链霉菌3704杀虫成分及对小菜蛾的毒力测定

沈会芳，张广文，林壁润*，蒲小明

1广东省农业科学院植物保护研究所广东省植保新技术重点实验室，广州 510640;2暨南大学药学院，广州 510632

杀虫抗生素是一类由微生物产生的具有杀虫活性的次级代谢产物，具有高效、专化和对环境安全等特点。从20世纪50年代，开始对杀虫抗生素进行研究，其中阿维菌素是开发最成功的品种［1］，自投放市场以来，成为继Bt制剂、井冈霉素之后的生物农药产业又一支柱产品。我国农用抗生素研究起步于20世纪80年代，相继研发出一批新品种，如浙江农科院的杀蚜素、上海农药研究所的浏阳霉素、上海农科院植保所的韶关霉素［2］、江西农业大学的南昌霉素和梅岭霉素等［3］。但害虫具有多样性，且对现有的农药品种不断产生抗药性，这要求不断开发新农用抗生素以满足农业生产需要。

本课题组在东南亚及中国内地采集土壤样品，分离链霉菌近3000株，以蔬菜重要害虫小菜蛾(Plutella xylostella)为靶标筛选杀虫抗生素，获得杀虫素3704，该活性物质对小菜蛾、蚜虫和水产害虫锚头蚤有较好的杀虫效果。本文报道了杀虫素3704对小菜蛾的生物活性，并对该活性物质进行分离鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料

链霉菌3704(Streptomyces sp.)分离自乌鲁木齐伊宁那抗提的沿河树林，在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC No:M206067。

小菜蛾(P.xylostella)于室内人工饲料继代培养。

培养基:生长培养基:高氏一号琼脂;发酵培养基:葡萄糖2%、可溶性淀粉1%、豆饼粉1.5%、玉米浆 1.5%、NaCl 0.5%、CaCO30.3%、pH 7.0 ～7.2。

1.2 实验方法

1.2.1 杀虫素3704粗提物的制备

将链霉菌3704斜面成熟孢子制成孢子悬浮液，接入发酵培养基中进行液体发酵培养，接种量为10%，发酵温度30℃，转速150 rpm，发酵培养96 h后，离心，保留菌丝体，用60%的丙酮浸泡12 h，离心后，保留浸泡液。用大孔树脂对浸泡液进行吸附后，丙酮洗脱，然后减压浓缩，得到棕色油状物，为杀虫素3704的粗提物。

1.2.2 杀虫素3704粗提物对小菜蛾2龄幼虫的杀虫活性

将杀虫素3704粗提物用丙酮配制不同浓度的溶液，把菜心叶片浸泡于溶液中30 min，取出，自然晾干，将30头2龄小菜蛾幼虫接到处理后的菜心叶片上，每处理3个重复，在28℃条件下养殖，每24 h调查死亡虫数，计算药剂LC50及其回归方程。杀虫素粗提物溶液浓度分别为 1.75、3、17.5、30、175 和350 μg/mL，对照用纯丙酮溶液处理。

1.2.3 杀虫素3704粗提物对小菜蛾2龄幼虫的盆栽防治试验

挖取大小较一致约有5片叶的菜心植株，移栽于花盆中，每盆3棵。移栽7d后，每盆接50头以上大小较一致的2龄小菜蛾幼虫，24 h后，检查植株上虫量，若有逃逸则补足50头，用手持喷雾器对叶片正反面及茎均匀喷施药液。杀虫素3704粗提物浓度分别为500、250和125 μg/mL，阿维菌素浓度为8 μg/mL，每处理设3个重复，另设置清水对照。施药后48、72、96 h调查植株上的活虫量，计算虫口减退率和防治效果。

1.2.4 杀虫素3704活性组分的分离纯化及结构鉴定

将3704粗提物加水混合均匀后，分别用乙酸乙酯、正丁醇分配萃取各三次，利用其杀虫活性跟踪有效物质，经真空液相层析(VLC)，以石油醚/乙酸乙酯溶剂体系梯度洗脱，共得到9个组分。经活性检测，其中主要组分3704-1具有杀虫活性，将其进一步进行纯化，获得纯品，进行化学结构鉴定。

2 结果与分析

2.1 杀虫素3704粗提物对小菜蛾2龄幼虫的杀虫活性

从表1可见，杀虫素3704粗提物对小菜蛾2龄幼虫的杀虫活性为 24 h时 LC50为 59.82842 μg/mL，48 h 为 38.66165 μg/mL，72 h 为 22.69325 μg/mL。可见随着处理时间的延长，对小菜蛾2龄幼虫的杀虫活性的LC50越来越小，72 h的LC50比24 h的LC50降低近2.2倍，表明随着处理时间的延长，杀虫素3704对小菜蛾2龄幼虫的杀虫活性越高。

表1 3704粗提物对小菜蛾2龄幼虫的生物活性Table 1 Insecticidal activities of the crude extract of 3704 against the 2ndinstar larvae of P.xylostella

2.2 杀虫素3704粗提物对小菜蛾2龄幼虫的盆栽防治试验

从表2可知，施药后48 h，3704粗提物的500 μg/mL剂量对小菜蛾2龄幼虫的防治效果与阿维菌素的8 μg/mL剂量的同期防效相当，当施药时间延长到72和96 h后，500 μg/mL的3704粗提物的防治效果则稍低于8 μg/mL的阿维菌素的同期防效。

表2 3704粗提物对小菜蛾2龄幼虫的盆栽防治效果(%)Table 2 The control efficacy of the crude extract of 3704 against the 2ndinstar larvae of P.xylostella in pots

2.3 杀虫活性成分结构鉴定

杀虫活性成分3704-1为无色片状结晶，活性成分m.p.111～113 ℃。由 ESI-MS m/z 387［M+Na］+得知分子量为364，结合13C NMR谱显示有28个碳、DEPT谱显示有6个甲基，1个亚甲基和5个次甲基，元素分析表明化合物3704-1中含有硫、氮和氯，并根据偶氮规则，分子中应含有两个N原子，可确定化合物3704-1分子式C19H25ClN2OS，不饱和度为 8。经1H NMR谱、13C NMR谱、1H-1H COSY谱、HMBC谱、DEPT谱和HSQC谱等综合分析，与已有化合物进行比对，链霉菌3704产生的杀虫活性成分为已知物Pyridaben，中文名哒螨酮，系统名为2-叔丁基-5-(4-叔丁基苄硫基)-4-氯-3(2H)-哒嗪酮(图1)。

图1 化合物3704-1的结构式Fig.1 Chemical structures of compound 3704-1

Pyridaben是日本日产化学工业公司1984年发现的哒嗪酮类化合物，1991年商品化，对植食性害螨整个生长期和粉虱、蚜虫、蓟马等均有效。对益虫安全，对哺乳动物毒性低，LD50(鼠)820～135 mg/kg，在环境中的持效期短，DT50为20 d。目前，该品种在我国已有较多企业生产并广泛应用，是我国杀螨剂的主要品种之一。

3 结论

本研究以小菜蛾为靶标筛选出链霉菌3704，3704粗提物对农业重要害虫小菜蛾有较好的杀虫活性，随着处理时间的延长，对小菜蛾2龄幼虫杀虫活性的LC50越来越小，表明其杀虫活性越高。盆栽防治试验发现，施药48 h，3704粗提物500 μg/mL剂量对小菜蛾2龄幼虫的防治效果与8 μg/mL剂量的阿维菌素相当，但随着处理时间的延长到72和96 h，其防治则稍低于阿维菌素。

3704杀虫活性物质化学结构经鉴定为已有并商品化的杀螨剂Pyridaben，Pyridaben自发现以来一直以化学方法进行合成生产，本研究首次从微生物次级代谢产物中分离出该活性物质。Pyridaben属哒嗪酮类化合物，该类化合物通过在辅酶Q位点上与复合物I键合来抑制线粒体的电子传递链，从而高效阻止线粒体的分离的复合物I氧化作用，达到杀死虫体的效果［4］。本研究发现Pyridaben对小菜蛾也有较好的杀虫效果。

1 Mrozik H，Eskola P，Linn BO.Discovery of novel avermectins with unprecedented insecticidal activity.Experientia，1989，45:315-316.

2 Liu X(刘旭)，Liu HL(刘虹伶)，Xia XQ(夏先全).A progress and development foresight of antibiotic insecticides.Southwest China J Agric Sci(西南农业学报)，2007，20:1283-1286.

3 Sun YH(孙宇辉)，Zhou XF(周秀芬)，Tu GQ(涂国全)，et al.Overview and prospect on the study of secondary metabolites and metabolic engineering of Streptomyces nanchangensis.Chin Bull Life Sci(生命科学)，2005，17:207-210.

4 Yuan JZ(袁建忠)，Tang ZH(唐振华).Acaricide and its reacting mechanism.World Pest(世界农药)，2005，27(6):1-5.