黄芪SSR 位点研究

王 文，王金胜

（山西农业大学生命科学学院，山西太谷030801）

SSR又称微卫星（Microsatellite），为简单序列重复（Simple Sequence Repeat），是由 1～5个核苷酸组成的首尾相连重复多次的短DNA序列[1-3]。Tautz等[4]研究发现，SSR在真核生物中具有普遍性和广泛性。可以通过设计特异性引物对SSR位点进行PCR扩增，然后使用琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳技术检测具有简单重复序列的DNA多态性[5-6]。

黄芪为豆科黄芪属植物，其正品黄芪为蒙古黄芪和膜荚黄芪的干燥根。目前，市场上有一些伪黄芪，其与正品黄芪在形态、性状及化学成分上都极为相似，所以用传统的鉴别方法很难将其鉴别[7-8]。近年来，不断发展的DNA分子标记技术[9-12]为黄芪的品种鉴定提供了新的方法。其中，SSR分子标记具有多态性高、重复性好、稳定性高、多等位性、共显性和对基因组有很好的覆盖性等特点，具有很强的实用性。现在已经证明，SSR引物在同科不同属的物种间甚至是不同科的物种间也可扩增出重复序列。由于黄芪的分子生物学研究较少，已公布黄芪的EST序列只有140多条，仅能设计出少量的黄芪SSR引物。

本试验从大豆中筛选出30对SSR引物，与设计的引物，相辅助对黄芪进行分子标记，旨在成功扩增出SSR位点的引物，用来鉴别黄芪的真伪。

1 材料和方法

1.1 供试材料

2012年8月在山西农业大学生命科学学院的中草药园中，分别采集膜荚黄芪、蒙古黄芪和华黄芪新鲜幼嫩的叶片。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA的提取 其采用CTAB高盐法，具体步骤为：称取黄芪嫩叶0.2 g，用灭菌蒸馏水将其洗净晾干后，移入预冷的研钵中，加液氮研磨至粉末状，分装至2.0 mLEP管中，向管中加入1.0 mL预热的2×CTAB提取液（在水浴锅预热至65℃）和20μL的β-巯基乙醇，混匀，放入65℃的水浴锅中预热40 min，并不时轻轻摇动；室温下12 000 r/min离心10 min，取上清至新的EP管（若有悬浮物再离心）；加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）抽提液，轻轻颠倒摇匀，室温下12 000 r/min离心10 min，取水相至新的EP管；加入等体积的氯仿∶异戊醇（24∶1）抽提液，轻轻颠倒摇匀，室温下12 000 r/min离心10 min，取水相至新的EP管；向EP管加入1/2体积的5 mol/L NaCl和3/4体积的异丙醇，轻轻摇匀，在-20℃冰箱静置30 min，沉淀DNA；4℃，12 000 r/min离心10 min，弃上清，回收DNA沉淀；用70%乙醇洗涤沉淀2次，自然干燥；将DNA溶于 50μL灭菌TE中，加入 0.5μL（100μg/mL）RNaseA，轻轻摇匀，37℃温浴1 h，短期内4℃保存备用。

1.2.2 DNA完整性和纯度的鉴定

1.2.2.1 DNA完整性的鉴定 取5μL溶解的DNA，加入2μL溴酚蓝试剂和1%的琼脂糖凝胶，采用DYY-5型稳压稳流电泳仪，在120 V电压下电泳30 min，电泳缓冲液是pH值为8的0.5×TBE。在凝胶电泳图像分析仪上进行拍照分析，结果如图1所示。

1.2.2.2 DNA纯度的鉴定 用双蒸水稀释40倍（取5μL样加入200μL的双蒸水）至每毫升含5～50μg DNA范围，同时以双蒸水作空白对照。于核酸蛋白质质量检测仪下测出A260/A280的值，每样品重复2次。

1.2.3 引物的筛选与设计 本试验借用同科植物大豆的30对SSR引物，同时根据NCBI中已经公布的140多条EST序列，使用DNASTAR.Lasergene.v 7.1，SSRHunter 1.3，premier 3.0尝试着设计引物，并根据引物设计的最适原则选取了最优的1对SSR引物[13-15]。

1.2.4 引物的PCR扩增 通过对蒙古黄芪、膜荚黄芪和华黄芪的DNA进行PCR扩增，筛选可以扩增出具有明显多态性的引物。部分引物序列如表1所示。扩增的条件经过梯度PCR仪器优化后为：预变性 94℃ 3 min；94℃ 40 s，Tm（退火温度）30 s，72℃ 60 s，35个循环；72℃ 8 min；4℃10 min。

表1 具有多态性的引物

1.2.5 PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳

对PCR扩增的产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，并用银染法进行显色，最后对试验结果进行拍照。

2 结果与分析

2.1 DNA提取方法的选择

本试验采用CTAB高盐法提取黄芪新鲜幼叶中的DNA，试验结果如表2所示。由表2可知，提取的黄芪DNA其纯度的比值均在1.80～2.00之间，质量分数在1 659.32～1 990.28μg/g之间，无RAN和蛋白的干扰。说明CTAB高盐法适合于提取黄芪基因组DNA。

表2 所测样品的DNA纯度和质量分数

2.2 引物的扩增结果

从试验结果可以得出，选取大豆的30对SSR引物中有6对在黄芪扩增中出现了SSR等位基因（图 2），其编号分别为 598，168，406，315，322，215，并且根据EST序列设计的1对SSR引物（其编号暂定为1a1b）也同样扩增出了等位基因。从成功扩增出等位基因的这7对引物中可明显看出，不同物种中每对引物扩增出的SSR等位基因的数目、大小几乎都有一定的差异。说明不同物种中不同的SSR位点，其侧翼序列或重复序列本身具有差异性及具有不同程度上的保守性。

这7种引物在蒙古黄芪、膜荚黄芪和华黄芪中，扩增出的SSR等位基因数如表3所示。从图2还可以看出，这3种材料很多位点的条带都很接近，差别甚至只有几个bp到十几个bp，这可能是由SSR重复次数的微小差异造成的，表明了SSR位点的多态性。

表3 引物在各物种中扩增的SSR等位基因的数目

3 结论

本试验的结果表明，用CTAB高盐法提取黄芪幼叶的DNA，可以得到完整的具有较好纯度和高质量分数的DNA。在对材料基因组信息没有太多了解的基础上，借用同科植物的SSR引物和根据EST序列设计SSR引物，可以避免构建DNA文库的麻烦，节省开支，方法有效可行。本试验所筛选和设计的SSR引物可以用来鉴别黄芪的真伪。

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