酵母双杂交表达载体pGBKT7_NPR1与pGADT7_NPR1的构建及酵母菌的转化

肖 牧，徐 健，何 乐，刘春林，阮 颖*

(1湖南农业大学生物科学技术学院，长沙410128;2湖南农业大学作物种质创新和资源利用国家重点实验室培育基地，长沙410128)

拟南芥NPR1是水杨酸(Salicylic acid)介导的系统获得性抗性(systemic acquired resistance，SAR)途径中不可或缺的一个转录辅助因子，其包含的BTB/POZ结构域［1］以及锚蛋白重复序列是行使其生物学功能的基础［2］。在SA诱导下，NPR1被转入到细胞核内并与一些转录因子结合，启动下游基因的表达。它介导植物对一系列水杨酸途径应答的植物病原菌，如 Pseudomonas syringae和 Peronospora parasitica的抗性。拟南芥中，过量表达NPR1能够增加植物对水杨酸或者功能类似物，如MeSA、BTH的敏感性，但并不会导致植物的形态改变，在未受到诱导物或者病原菌刺激的情况下，病原相关基因PRs(pathogenesis－related gene)的表达水平亦不会出现明显上升。而在受到刺激后则表现出更强的PR1基因诱导以及对病原菌的抗性［2］。NPR1缺失突变背景下，拟南芥表现出对各种SAR诱导物不敏感、丧失PR基因表达以及对各种细菌病害易感性增强［3］。有关NPR1在水杨酸介导的SAR途径中的作用模式已有详尽报道［4］。已知 SAR过程中，NPR1被转运至细胞核内对于PR基因的转录激活是必需的，但NPR1蛋白质本身并不包含任何DNA结合序列，且行使生物学功能的两个关键结构域(BTB/POZ，ankyrin repeat)均参与蛋白质相互作用的过程，这暗示着NPR1在SAR过程中起着一个间接的调控作用［2］。进一步的研究表明，NPR1出入细胞核的过程受到SA及类似物触发的细胞内氧化还原电势调控［5］。NPR1蛋白之间通常以二硫键链接而形成多聚体的形态存在于细胞质内，在受到SA诱导后，细胞内氧化还原电势发生改变而引起二硫键被剪切，NPR1多聚体被还原成单体并被转运到细胞核内。NPR1在细胞核内与转录因子TGAs或者NIMINs结合，从而影响转录因子的DNA结合效率，进而从转录水平上对下游防御基因进行调控［6，7］。此外，NPR1 亦能够与拟南芥中与其本身同源的两个蛋白——水杨酸受体NPR3，NPR4分别相互作用，且作用模式依赖于接收的SAR信号的强度，进而经由泛素化过程，来调节NPR1蛋白水平，这个过程对于拟南芥中SAR的建立同样关键［4，8］。

为了进一步研究NPR1在植物防御反应中的作用，并阐明其在调节不同防御信号传导途径中的具体作用机制，本研究利用特异性引物扩增哥伦比亚野生型拟南芥中的NPR1基因，并将其分别克隆至pGBKT7、pGADT7酵母双杂交表达载体上，为利用酵母双杂交技术寻找与NPR1转录辅助因子相互作用的蛋白并进一步理解其在植物防御信号中的作用模式以及调控下游基因转录水平的机理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂

限制性内切酶(RE)EcoR I、BamH I、T4 ligase、PCR Mix、LongAmp Taq DNA polymerase、PMD19 － T载体购自Takara公司;琼脂糖(Agarose)购自西班牙Biowest;质粒提取试剂盒购自Ambiogen公司;柱式DNA胶回收试剂盒、标准分子量DNA Marker购自Transgen公司;酵母用培养基购自Sigma;其他常用试剂均为分析纯，购自上海国药。

1.1.2 质粒与菌株

大肠杆菌DH5α，酵母菌株(Gold菌株)，表达载体pGBKT7、pGADT7均为湖南农业大学植物代谢实验室保存。

1.2 方法

(1)引物设计。根据NCBI上查找到已公布的NPR1基因编码区序列(CDS，全长1 782 bp)，运用引物设计软件Primer Premier5，根据酵母表达载体pGBKT7、pGADT7的表达框及多克隆位点，在上下游引物5'端分别接入相应的酶切识别位点EcoR I及BamH I。克隆所用引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成。实验所用引物序列如下:

NPR1－F:5'GGAATTCCATGGACACCACCAT TGATGGATTCG 3'

NPR1－R:5'CGGGATCCCGTCACCGACGACG ATGAGAGAGTTTA 3'

(2)重组酵母双杂交质粒示意图如下:

图1 pGBKT7_NPR1载体构建示意图

图2 pGADT7_NPR1载体构建示意图

(3)PCR反应体系。总体积50 μL，无菌去离子水 20 μL，Buffer 6 μL，引物 (10 μM)各1.2 μL，long Taq(2.5 μL)1.2 μL，dNTP(10 mM)0.9 μL，模板cDNA(100 ng)1 μL(拟南芥 cDNA)。

反应参数:94℃ 变性 30 s，55℃ 退火 30 s，72℃延伸120 s，运行30个循环。

(4)T载体连接及大肠杆菌转化。将PCR扩增得到目的片段和pMD19－T载体片段进行连接反应，体系为 10 μL(1 μL vector，4 μL DNA，5 μL solutionⅠ)(具体操作参见Takara公司试剂盒说明书)。

(5)酵母双杂交载体构建。使用限制性内切酶EcoR I、BamH I对 PMD19－T_NPR1重组质粒和pGBKT7、pGADT7载体分别进行双酶切(酶切体系参见Takara公司试剂盒说明书)，琼脂糖电泳后回收目的基因片段和表达载体片段(操作参见Transgen公司试剂盒说明书)。在T4连接酶连接体系中将目的基因片段分别与两个表达载体片段连接后，转入大肠杆菌。挑取阳性克隆进行PCR验证后提质粒进行酶切验证。

1.3 重组质粒转化酵母细胞

(1)酵母感受态细胞的制备。本实验采用醋酸锂介导转化法分别将两个重组质粒转化至Gold酵母菌株(操作流程以及选用试剂参见Clontech公司MatchmakerTMGold Yeast Two－Hybrid System User Manual)。

(2)重组质粒的转化。将鲑鱼精 DNA、酵母感受态细胞以及重组质粒混匀后加0.7 mL PEG/LiAc溶液，30℃振荡培养30 min，再加入0.07 mL DMSO混匀，于42℃热激15 min，冰浴15 min，离心后弃上清，将沉淀重悬于1.5 mL 1×TE缓冲液中，分别涂布至缺少相应氨基酸的SD筛选平板。28℃恒温箱里倒置培养，直至长出酵母阳性克隆。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增拟南芥NPR1基因

图3 LongAmp酶扩增得到的NPR1全长CDS

以引物的Tm降低5℃为基准，上下加减5℃设计退火温度梯度 PCR，确定最佳的退火温度为55℃。以55℃为退火温度进行PCR扩增，PCR产物经过1.5%琼脂糖凝胶电泳分离出目的片段，大小与预期一致(1 800 bp左右)(图3)。

2.2 NPR1全长CDS与T－Vector连接及测序结果分析

切胶回收扩增出的1 782 bp左右的目的片段，在T4连接酶作用下将其连接到pMD19－T，热激法转化大肠杆菌DH5α，取100 μL菌液涂布于LB固体培养基上(含有氨苄青霉素50 g/mL)生长，筛选获得阳性克隆。随机挑选数个单菌落进行PCR检测，筛选获得转化子。

挑取菌落PCR检测为阳性的单菌落，接种至含有50 mg/mL Amp的5～10 mL LB液体培养基中，37℃、220 rpm振荡培养。过夜后提取质粒，利用EcoR I、BamH I进行双酶切验证。挑选验证正确后的克隆测序，测序结果显示去除酶切位点后序列长度为1 782 bp。经NCBI BLAST比对，与已公布的拟南芥NPR1全长CDS序列一致。

2.3 酵母表达载体的构建

将测序结果与已公布序列比对完全一致的NPR1片段与载体pGBKT7、pGADT7分别经EcoR I、BamH I双酶切后，用T4连接酶连接，构建酵母双杂交表达载体pGBKT7_NPR1与pGADT7_NPR1。将连接产物转化大肠杆菌得到阳性克隆后，进行单、双酶切验证(图4)。双酶切后电泳检测到约1 800 bp的目的片段，说明载体构建成功。用BamHⅠ进行单酶切时出现两条带可能是由于单酶切体系中的BamHⅠ错误识别碱基序列并进行切割或者由于质粒在大肠杆菌中进行复制时出现碱基突变所致。

图4 pGBKT7_NPR1与pGADT7_NPR1质粒酶切结果

2.4 重组质粒的酵母菌转化

将重组质粒pGBKT7_NPR1与pGADT7_NPR1分别转化至Gold酵母菌株中，热激转化后将菌悬液涂布于SD/－Trp与SD/－Leu培养基上，28℃恒温培养2～3 d后，观察酵母菌的生长情况(图5)。结果表明，重组质粒已成功转入到宿主酵母菌细胞内。

图5 含NPR1 CDS重组质粒的Gold酵母菌转化子

3 讨论与小结

在各种植物防御途径中，SA介导的系统获得性抗性(SAR)已见大量报道，并且被认为是植物应对细菌性病害过程中十分关键的机制［9］。SAR过程发生在受感染植株的健康部位中。植物局部组织受到病原菌侵染后，一类可移动的信号分子通过维管系统运输至其它部位并且启动相应的免疫应答反应［10］，如激素水平提高、防御基因表达、次级代谢物累积、形态学改变等。水杨酸作为SAR信号途径起始位点中必不可少的一种信号分子，它介导着一大类编码具有抗菌作用的蛋白质的基因表达［11］。在水杨酸信号传导途径中，NPR1被证明是必需的一个反式作用因子［3］。水杨酸信号导致细胞内氧化还原电势的改变，NPR1被转运进入到细胞核内，并与一些转录因子相互作用［12］，进而调控防御基因的转录［1，2，6，7，13］。然而，SA途径与其它信号途径的相互调节作用机理尚不清楚。因此，研究NPR1与其它可能参与调控的蛋白质相互作用模式十分必要。

本研究利用基因重组将拟南芥NPR1全长CDS分别克隆到酵母表达载体pGBKT7与pGADT7中。重组质粒通过大肠杆菌转化获得了阳性克隆，经过菌落PCR及单、双酶切验证重组质粒构建成功。将重组质粒又转化到Gold酵母菌中，并且在相应筛选培养基上成功获得了转酵母菌成功的阳性克隆。本研究结果为利用NPR1进行酵母筛库以及蛋白相互作用的验证奠定了实验基础，有利于进一步研究NPR1与其它可能参与调控的蛋白质相互作用模式，进一步阐明NPR1在信号传导途径互作中行使的功能。

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