三黄鸡ST6基因的半定量RT－PCR分析

周 飞，于 梦，刘荣昌，袁远华，宁章勇

（1．华南农业大学兽医学院，广东 广州510626）

唾液酸（Sialic acid，SA）是神经氨酸的衍生物，作为流感病毒的受体，唾液酸与流感病毒的血凝素（HA）相结合，介导流感病毒侵入机体的细胞。唾液酸以α2，3或α2，6键连接于聚糖或糖脂上，在流感病毒的侵入和流感的发生与发展中起着关键作用［1－2］。唾液酸是由唾液酸转移酶以9－磷酸－N－乙酰神经氨酸或9－磷酸去氨基神经氨酸为底物催化而来的［3－5］，不同的亚型又对不同的糖链或脂链有相应的偏嗜性［6］。禽流感病毒偏嗜与SAα2，3Gal结合，人流感病毒偏嗜与SAα2，6Gal结合［7－9］，这一特点在很大程度上限制了流感病毒的跨物种传播。此外，唾液酸还可以作为病原微生物逃逸宿主免疫系统的分子模拟器［9］。唾液酸转移酶表达丰度的高低直接影响了唾液酸的分布与密度，所以唾液酸转移酶的上调和下调对动物机体对流感病毒的感染及流感的发生与发展起着重要的作用。本文首次通过NCBI上已公布的鸡的ST6序列设计了引物。通过RT－PCR克隆了鸡的ST6GalⅠ序列和ST6GalⅡ序列，并检测了ST6基因的表达谱。

1 材料与方法

1．1 试验材料 1月龄的三黄鸡来自华南农业大学兽医院禽病教研室，经检测未见禽流感的感染。处死后取其心，肝，脾，肺，肾，脑，腔上囊，胸腺组织。组织样品冻存于液氮中，用于总RNA的提取。

1．2 总RNA的提取 取液氮中的组织样品150 mg，在液氮中研碎后，用Trizol法提取总RNA。溶于无RNA酶的水中，－80℃保存备用。

1．3 逆转录反应 逆转录RT反应的具体过程参照逆转录试剂盒说明书进行，逆转录RT反应的总体系为20μL。逆转录出的cDNA放于－80°保存备用。

1．4 半定量RT－PCR 半定量RT－PCR的内参基因为鸡的β－actin基因（登录号：NM＿205518）。上游引物为5′－GAGGCTACAGCTTCACCACCACA－3′，下游引物为：5′－CCACAGGACTCCA TACCCAAGAA－3′，扩增基因片段长度为232bp，退火温度：59℃。用于半定量ST6GalⅠ（登录号：NM＿205241）的上游引物为：5′－GTGAAATGGGTCAGATGCCTAAA－3′，下游引物为：5′－CCATTAAACCGCAAGACAGCATC－3′，扩增长度为463 bp，退火温度：56℃；ST6GalⅡ（登录号：NM＿001167747）的上游引物为：5′－TGAGGAGAAGGAGCACAAAGC ACAG－3′，下游引物为：5′－CCAGCAGACATAACTACGGCACAGC－3′，扩增长度为391bp，退火温度：55℃。其中β－actin和ST6的反应扩增体系都为25μL，其中10×PCR Buffer 2．5μL ，dNTPs 2μL（各2．5mmol／L），上游引物和下游引物各1μL（20μmol／L），0．2μL ExTaq酶（5U／L－），模板cDNA 2．5μL，超纯水15．8μL。PCR反应条件为：94℃ 预变性10min；94℃ 变性30s；52℃退火40s；72℃延伸40s，经过一定循环数后与72℃总延伸10min；－20℃保存。其中反应循环数采用28、29、30、31、32、33、34、35个［10］共8个不同循环数扩增ST6和β－actin基因，筛选用于半定量的最适反应循环数。反应产物用2%琼脂糖凝胶进行检测照相，半定量分析软件用Gel－Proanalyzer 4 进行，计算 ST6 与 β－actin 的比值，比值表示目的基因的相对表达量。

2 结果与分析

利用ST6特异性引物扩增出的产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示，所扩增的ST6基因和β－actin基因片段的大小与预期的相符，测序结果显示所克隆的片段为三黄鸡ST6基因和β－actin基因片段。

最佳循环数检测结果显示，ST6和β－actin基因在28～35循环数之间均出现目的条带且基因产量呈线性扩增，没有进入平台期。为了获得理想的试验结果，将试验中ST6和β－actin的半定量PCR循环数优化为33个循环（图1和图2）。

取等量不同组织的总RNA，经过RT－PCR 33个循环扩增。经 Gel－Proanalyzer 4分析后表明，ST6基因在三黄鸡的8个组织中均有表达，其中ST6GalⅠ在心脏中表达最高，脑中最低；ST6GalⅡ在胸腺中表达最高，在肝脏中表达最低，而ST6GalⅠ在各组织中的表达比其相应组织中的ST6GalⅡ的表达要低（图2）。

3 讨论

作为糖基转移酶成员之一的唾液酸转移酶，在唾液酸的合成中起着重要作用。ST6主要催化α2，6唾液酸的合成，且其偏嗜使Ⅱ型聚糖链（Galβ1，4GlcNAc2R）唾液酸化，唾液酸转移酶在组织中的丰度直接影响着唾液酸在不同组织中的分布。

本研究根据GenBank上的ST6所公布的序列，设计引物，成功对三黄鸡ST6GalⅠ和ST6GalⅡ基因进行了组织表达谱的分析，结果发现ST6基因在心、肝、脾、肺、肾、脑、腔上囊、胸腺这8种组织中都有表达，ST6GalⅠ在心表达量最高，在脑表达最低，其表达量从高到底依次为：心、脾、肝、胸腺、肾、腔上囊、肺、脑；ST6GalⅡ在胸腺表达量最高，在肝表达最低，其表达量从高到底依次为：胸腺、腔上囊、肺、肾、脾、脑、心、肝。Smitha PS Pillai，马明［11－12］等人通过免疫组织化学法检查到SAα2，6Gal在鸡各组织中的分布，本研究的结果与其相似。本研究在mRNA水平上证实了ST6的表达，至于SAα2，6Gal是由ST6GalⅠ还是ST6GalⅡ亦或是由两种酶同时催化而成的，还需要进一步研究。

由于唾液酸是流感病毒侵入机体的受体，而唾液酸转移酶又是催化唾液酸和糖链合成的关键酶，所以曹文雁［13］、van Wielink R［14］等人通过提高唾液酸转移酶的表达丰度，从而提高了细胞培养流感病毒的滴度。所以本研究对ST6基因的两个亚型在各组织间表达丰度进行了比较，为流感病毒入侵细胞机制的研究和发展受体依赖性流感病毒细胞培养技术提供了基础数据。

［1］ Viswanathan K，Chandrasekaran A，Srinivasan A，etal．Glycans as receptors for influenza pathogenesis［J］．Glycoconj J，2010，27（6）：561－570．

［2］ Schauer，R．Achievements and challenges of sialic acid research［J］．Glycoconj J，2000，17（7－9）：485－499．

［3］ Roland S．Sialic acids：fascinating sugars in higher animals and human［J］．Zoology，2004，107（1）：49－64．

［4］ 周飞，崔连成，安玉甫，等．三黄鸡ST3Gal6基因的半定量RTPCR及生物信息学分析［J］．中国畜牧兽医，2012，39（3）：51－54．

［5］ Varki，A．Diversity in the sialic acids［J］．Glycobiology，1992，2（1）：25－40．

［6］ Hardin－Lepers H，Mollicone R，Delannoy P，etal．The animal sialyltransferases and sialyltransferase－related genes：aphylogenetic approach［J］．Glycobiology，2005，15（8）：805－817．

［7］ Suzuki Y，Ito T．Sialic acid species as a determinant of the host range of influenza virus［J］．J Viro，2000，74（24）：11825－11831．

［8］ Suzuki Y．Sialic biology of influenza：molecular mechanism of host range variation of influenza virus［J］．Biol Pharm Bull，2005，28：399－408．

［9］ 潮潭，陈勇．流感病毒的受体结构与跨越物种传播的分子机制［J］．国外医学，2005，32（2）：80－83．

［10］Poonam Y，Manishi M，Ranjit S，etal．Semi－quantitative RTPCR analysis of fat metabolism genes in mammary tissue of lactating and non－lactating water buffalo（Bubalus bubalis）［J］．Trop Anim Health Prod，2012，44：693－696．

［11］马明，刘月焕，陈明勇，等．鸡、鸽、虎呼吸道和消化道黏膜上皮细胞表面流感病毒受体类型的检测［J］．中国农业科学，2009，42（8）：2958－2965．

［12］Pillai S P，Lee C W．Species and age related differences in the type and distribution of influenza virus receptors in different tissues of chickens，ducks and turkeys［J］．Virol J，2010，7：5．

［13］曹文雁．稳定表达鸡ST3GalI的 MDCK细胞系的建立［C］．2008，27－28．

［14］van Wielink R，Kant－Eenbergen H C，Harmsen M M，etal．Adaptation of a Madin－Darby canine kidney cell line to suspension growth in serum－free media and comparison of its ability to produce avian influenza virus to Vero and BHK21cell lines［J］．J Virol Methods，2011，171（1）：53－60．