EMA－PCR检测金黄色葡萄球菌活菌的方法

赵素君，李江凌，谢 晶，曹 冶，王秋实，叶勇刚，罗丹丹，叶健强，廖党金

（四川省畜牧科学研究院，四川 成都610066）

金黄色葡萄球菌（SA）是一种重要的人畜共患病病原，是引起细菌性食物中毒以及人和动物感染的重要病原菌之一。目前，细菌分离培养仍是金黄色葡萄球菌检测的常规方法，该法虽然可靠，但耗时、费力不能满足快速检测的需要；而免疫学方法对各种致病因子的检测，因毒素因子血清型复杂且同源性高，在检测过程中难免出现血清型之间的交叉反应，导致假阳性，同时因检测灵敏度低导致出现假阴性。总之，采用传统的方法对该菌的检测存在很大的局限。PCR技术以灵敏度高、特异性强、简便和快速等优点被越来越多地应用于金黄色葡萄球菌的检测中。

金黄色葡萄球菌能产生多种毒素和酶，其中由nuc基因编码的耐热核酸酶（Thermostable Nuclease，TNase），是一种侵袭性酶，能迅速分解核酸，利于病菌的扩散。nuc基因不仅为金黄色葡萄球菌所特有，而且在不同菌株之间具有较高的保守性，因此，很多研究采用了nuc基因作为扩增的靶基因［1－4］。

传统PCR技术无法区分样品中的死菌与活菌，虽然死菌已经没有危害性，但其DNA长期存在，死菌DNA在PCR检测中也能扩增出目的基因，从而使检测结果出现大量的假阳性，干扰了检测的真实性。叠氮溴乙锭（Ethidium monoazide bromide，EMA）是一种荧光插入型的核酸结合染料，能穿过死细菌的细胞膜，在光激活的作用下与基因组DNA共价结合，从而能抑制样品中死菌体的DNA进行PCR扩增；而完整未受损伤的活菌细胞膜能阻止EMA渗透，对活菌DNA不起作用［5－6］。本试验将EMA与PCR技术结合，通过特异性扩增耐热核酸酶编码基因nuc基因，建立一种快速、有效的检测金黄色葡萄球菌活菌的方法。由于在检测过程中除去了死细胞DNA对PCR的干扰，从而大大提高了检测的准确性和真实性，为金黄色葡萄球菌病原检测提出了一个全新的手段。

1 材料与方法

1．1 菌株 阳性菌株：金黄色葡萄球菌CVCC3055、CVCC3056；对照菌株：肠毒性大肠杆菌CVCC196、CVCC197、CVCC200、CVCC211、CVCC215，肠出血性大肠杆菌CVCC248，肠侵袭性大肠杆菌CVCC2072，肠致病性大肠杆菌CVCC251，沙门菌CVCC504，均购自中国兽医药品检查所中国兽医微生物菌种保存管理中心。

1．2 主要试剂 EMA为Biotium公司产品；TaqDNA聚合酶、dNTPs、DL－2 000DNA Marker，购自TaKaRa公司；其他化学试剂均为国产分析纯；引物合成及核酸测序由Invitrogen公司完成。

1．3 引物设计与合成 根据GenBank中金黄色葡萄球菌nuc基因序列设计引物如下，F：5′－TTAGCCAAGCCTTGACGAAC－3′；R：5′－AGGGCAATACGCAAAGAGGT－3′，扩增目的片段长度为480bp。

1．4 金黄色葡萄球菌活菌和死菌的制备 接种金黄色葡萄球菌CVCC3055，培养16h后，取1mL菌液于EP管中，6 000r／min（4℃）离心5min，收集菌体沉淀，加入无菌生理盐水重悬沉淀，制成活菌悬液。再将活菌悬液72℃水浴15min，得到死菌悬液。

1．5 EMA处理 取适量菌悬液于EP管中，加入终浓度为100g／mL的EMA，在黑暗处放置5min后，于650W卤素光源光照处理1min，光源放在离样品管20cm处，光照时EP管放在冰上，以免样品温度过高。EMA处理后的样品，用于下面的DNA模板的制备。

1．6 模版DNA的制备 取1mL菌液，12 000r／min离心5min，去除上清液，然后用100μL灭菌去离子水重悬，然后100℃水浴5min后，再10 000r／min离心5min，上清液用作PCR检测。

1．7 PCR反应体系及反应条件优化 PCR反应体系：10×ExTaqBuffer（含 MgCl2）2．5μL，dNTP mixture（各2．5mmol／L）2μL，引物（20μmol／L）各0．5μL，模板 DNA 1μL，TaKaRa ExTaq（5U／L）0．2L，灭菌双蒸水加至25μL。

PCR反应条件优化主要通过退火温度来实现，为了获得特异性的扩增片段，采用Touchdown PCR方法确定PCR反应合适的退火温度，设定退火温度范围65℃～45℃。扩增结果经1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1．8 PCR特异性检测 以CVCC3055、CVCC3056作为阳性菌株；以 CVCC196、CVCC197、CVCC200、CVCC211、 CVCC215、 CVCC248、 CVCC2072、CVCC251、CVCC504作为阴性对照，进行PCR扩增，结果经琼脂糖凝胶电泳分析，用凝胶成像系统进行观察，出现特异性扩增条带，即为检测阳性，否则为阴性。

1．9 PCR灵敏度检测 接种金黄色葡萄球菌CVCC3055，培养16h，取1mL菌液于EP管中，递倍稀释10－1～10－9，进行如上模板DNA制备，PCR检测其灵敏度。同时，采用平板法进行细菌计数，通过牛肉膏蛋白胨琼脂平板进行对照计数。分别取递倍稀释100～10－9的菌液50μL进行涂板，37℃过夜培养，然后分别进行计数，计算检测灵敏度。

1．10 不同活细菌比例的混合菌悬液的EMA－PCR扩增 分别配制含有100%、75%、50%、30%、20%、10%、5%、4%、3%、2%、1%、0%的金黄色葡萄球菌CVCC3055活细菌菌悬液混合体系，分别加入终浓度为100μg／mL的EMA，在黑暗处放置5min后，样品置于冰上用650W卤素光源距离20cm处光照处理1 min，经EMA处理后的菌液，用于如上DNA模版的制备，进行PCR扩增。

2 结果

2．1 PCR反应条件的优化 经过Touchdown PCR方法确定最佳的PCR反应条件为：94℃3min；94℃30s、55℃30s、72℃45s，28个循环；72℃延伸5min。

2．2 金黄色葡萄球菌nuc基因的PCR特异性检测结果 PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示（见图1），只有金黄色葡萄球菌CVCC3055和CVCC3056扩增出480bp的目的条带，DNA测序结果经BLAST分析，与GenBank上序列完全一致。而对照菌株 CVCC196、CVCC197、CVCC200、CVCC211、CVCC215、 CVCC248、 CVCC2072、 CVCC251、CVCC504均未检测到特异性条带，结果为阴性。

2．3 金黄色葡萄球菌nuc基因的PCR检测灵敏度分析 将各梯度稀释液100～10－9分别进行nuc基因的PCR扩增，结果经琼脂糖凝胶电泳分析，如图2所示，其灵敏度检测低限为10－9，而相应的平板计数为15CFU／mL。

图2 PCR检测的灵敏性试验

2．4 金黄色葡萄球菌EMA－PCR区分死菌与活菌的检测结果 EMA－PCR扩增结果经琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示，除了全部是死菌的组外，其他含活菌各种比例的混合菌液中，均出现特异性扩增条带，见图3。

图3 EMA－PCR对金黄色葡萄球菌活菌／死菌混合物的检测

3 讨论

金黄色葡萄球菌能产生多种毒素，主要有肠毒素（Staphylococcal enterotoxins，SEs）、剥脱毒素（ETs）和中毒休克毒素（TSST－1）等［7］。由于金黄色葡萄球菌的致病性主要与各种毒素有关，因此对各种毒素基因的检测一直以来都是研究的热点。目前，虽然金黄色葡萄球菌各种毒素的基因都已克隆并测序，人们可以根据各种毒素基因的保守和特异序列，设PCR引物，从而对金黄色葡萄球菌各种毒素直接进行PCR检测，但不同菌株包含不同毒素基因，同一菌株也可包含多种肠毒素基因［8］，因其血清型复杂多样在实际样品的检测中仍存在一定的局限性。从而选择特异的靶基因在SA的PCR检测中至关重要。本试验选用由nuc基因编码的耐热核酸酶，作为鉴定金黄色葡萄球菌的重要指标。耐热核酸酶是金黄色葡萄球菌产生的一种细胞外酶，能迅速分解核酸，利于病原菌的扩散。nuc基因作为扩增的靶基因具有较高的种属特异性和保守性。

SA的检测方法主要有分离培养法、琼脂扩散法、免疫学检测法、血清学及核酸探针检测法，这些方法即费时费力，又易出现假阳性和假阴性，很难满足快速检测需要。PCR技术快速敏感、操作简便，成为近年来病原菌鉴定研究的热点。但在检测中传统PCR技术无法区分样品中的死菌与活菌，死菌DNA在PCR检测中也能扩增出目的基因，从而使检测结果出现大量的假阳性。本试验采用EMA－PCR技术，利用EMA能穿过死菌的细胞膜并在光激活的作用下能与基因组DNA共价结合，从而能抑制死菌DNA进行PCR扩增的特性，通过特异性扩增nuc基因，建立了一种快速、有效的检测金黄色葡萄球菌活菌的方法。由于在检测过程中通过EMA选择性的与混合细菌菌落中的死菌DNA共价结合，除去死菌DNA的PCR干扰，从而使检测结果准确、可靠，对金黄色葡萄球菌的检测具有较好的应用价值，在临床检测上具有重要的意义。

［1］ Cattoir V，Merabet L，Djibo N，etal．Clinical impact of a realtime PCR assay for rapid identification of Staphylococcus aureus and determination of methicillin resistance from positive blood cultures［J］．Clin Microbiol Infect，2011，17：425－431．

［2］ He J，Zhu J，Chao G，Zhu X，etal．［Isolation and identification of a Staphylococcus aureus small colony variants［J］．Wei Sheng Wu Xue Bao，2009，49：1397－1402．

［3］ Pinto B，Chenoll E，Aznar R．Identification and typing of foodborne Staphylococcus aureus by PCR－based techniques［J］．Syst Appl Microbiol，2005，28：340－352．

［4］ Shittu A，Lin J，Morrison D．Molecular identification and characterization of mannitol－negative methicillin－resistant Staphylococcus aureus［J］．Diagn Microbiol Infect Dis，2007，57：93－95

［5］ Lee J L，Levin R E．A comparative study of the ability of EMA and PMA to distinguish viable from heat killed mixed bacterial flora from fish fillets［J］．J Microbiol Methods，2009a，76：93－96．

［6］ Lee J L，Levin R E．Discrimination of viable and dead Vibrio vulnificus after refrigerated and frozen storage using EMA，sodium deoxycholate and real－time PCR［J］．J Microbiol Methods，2009b，79：184－188．

［7］ 傅丹青，陈棋炯，丁水军，等．金黄色葡萄球菌肠毒素基因的检测与分型［J］．中国卫生检验杂志，2011，21（5）：1167－1169．

［8］ 张凤笑，石磊．PCR技术在金黄色葡萄球菌中的研究进展［J］．现代食品科技，2008，24（10）：1042－1047．