牛奶中金黄色葡萄球菌的耐药性及其肠毒素分型研究

王 娟，黄秀梅，刘书科，李玉清，赵思俊，曲志娜，王玉东，王君玮

（1．中国动物卫生与流行病学中心，山东 青岛266032；2．山东省平度市崔召镇动物防疫监督站，山东 平度266752）

金黄色葡萄球菌是造成人类食物中毒的常见致病菌之一，并且在自然界分布非常广泛，因此食品受其污染的机会很多。近年来，美国疾控中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的食源性疾病位居第二位，占整个细菌性食物中毒的33% ，加拿大则更多，占45%，引起中毒的食品主要有奶、肉、蛋等及其制品。为了解我国目前生鲜牛奶中金黄色葡萄球菌的污染状况和耐药情况，本文对奶牛养殖大省山东、山西和内蒙的奶牛场和挤奶站采样进行监测，为指导奶牛养殖场安全合理用药和保障消费者食品安全提供有利保障。

1 设备与材料

1．1 设备 生物安全柜、恒温培养箱、冰箱、自动细菌鉴定仪、可见分光光度计、基因扩增仪、水浴锅、离心机、凝胶成像系统等。

1．2 材料 标准菌株 ATCC29213、7．5%NaCl肉汤、Baird－Parker琼脂、科玛嘉显色培养基、MH肉汤、冻干兔血浆、过氧化氢、dNTP、rTaq聚合酶、琼脂糖等。

2 样品来源

在山东省、山西省和内蒙古自治区共选择6个挤奶站和奶牛场进行样品采集，共采集鲜奶样品338份。

3 细菌分离鉴定

3．1 金黄色葡萄球菌分离 取1mL牛奶样品接种到10mL7．5%NaCl肉汤中，于37℃温箱培养20 h后，将增菌后的液体接种于Baird－Parker平板，36℃培养48h，然后挑取可疑菌落接种到科玛嘉显色培养基上［1］。

挑取可疑菌落，划线接种到营养琼脂纯化培养后，待进一步细菌鉴定。

3．2 金黄色葡萄球菌鉴定 通过生化方法和PCR方法进行鉴定。

3．2．1 生化鉴定 挑取纯化好的单个菌落进行触酶试验和血浆凝固酶试验。触酶试验阳性的菌落再进行血浆凝固酶试验；血浆凝固酶试验中，呈现凝集者判为阳性，则该菌为金黄色葡萄球菌阳性。

3．2．2 PCR方法 设计引物，上游引物 P1：5′－TCTTCAGAAGACGCGGAATA－3′，下游引物P2：5′－TAAGTCAAACGATACCATACG－3′。扩增片段长度为420bp标准菌株和临床牛奶样品中基因组DNA的提取按常规方法进行，以基因组DNA为模板进行PCR扩增。样本DNA扩增的PCR反应体系（25μL）：10×Buffer 2．5μL，上下游引物（25 pmol／μL）各1μL，dNTP（10mmol／μL），rTaq聚合酶0．25μL，DNA模板1μL，ddH2O补至25μL。PCR循环条件为：95℃预变性5min；95℃变性1 min，57℃退火50s，72℃延伸50s，扩增36个循环；最后72℃延伸10min。取PCR扩增产物5μL进行1．5%琼脂糖凝胶电泳（含EB0．5%μg／mL），电泳结束后，在紫外灯下观察并用电泳图像分析系统拍照，记录试验结果。PCR产物为420bp，阳性对照出现420bp的条带，检测分离菌也出现同样条带的，均判为金黄色葡萄球菌阳性。

图1 金黄色葡萄球菌PCR扩增结果

3．3 检测结果 从采集的338份生牛奶中，检出金黄色葡萄球菌39株，检出率为11．54% ，PCR结果与生化鉴定结果一致。结果说明，这些奶牛养殖场和挤奶站的生鲜牛奶存在金黄色葡萄球菌的污染，其主要源于在挤奶过程中污染了牛奶。因此，要防止金黄色葡萄球菌对奶及奶制品的污染。奶牛场要定期检查奶牛的乳房，并且奶挤出后，要迅速冷藏，以防细菌繁殖、毒素生成，奶制品要以消毒牛奶为原料，注意低温保存。食品中食源性致病菌的污染是引发食品安全问题的重要原因之一，因此，从源头上杜绝本菌对食品的污染，以降低金黄色葡萄球菌食物中毒的发生风险。

4 药敏试验

用微量肉汤稀释法测定所有菌株对8类13种抗菌药的最小抑菌浓度。8类13种抗菌药分别是：青霉素类（青霉素、氨苄西林、奥格门丁）；头孢类（头孢西丁、头孢噻呋）；大环内酯类（替米考星、红霉素、泰妙菌素）；万古霉素类（万古霉素）；磺胺类药物（磺胺异恶唑、新诺明）；氟喹诺酮类（恩诺沙星、氧氟沙星）。

4．1 金黄色葡萄球菌的耐药性 39株金黄色葡萄球菌对8类13种抗菌药的耐药性检测结果表明，除了对头孢噻呋、万古霉素以及奥格门丁没有耐药菌株外，对其他药物都有不同程度的耐药性。耐药性最严重的药物是磺胺类药物（磺胺异恶唑、新诺明），耐药率分别为97．44%、94．87%；其次是对青霉素类中的青霉素、氨苄西林，耐药率分别为92．31%、89．74%。耐药率在40%以上抗菌药有6种，共有对5种抗菌药的耐药率小于10%，这与张兰荣［2］、徐勤［3］等的试验结果基本吻合。

此外，头孢西丁可以作为筛选耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的药物，此次检测中，有1株菌株对头孢西丁耐药，但对头孢噻呋不耐药，有待于进一步确证是否是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。

分离菌株对青霉素类药中青霉素、氨苄西林的耐药率均在90%左右，而对奥格门丁的耐药率为0，相差悬殊；其次是对大环内酯类药物的耐药率在22．56%～53．85%之间；而对其余同类抗菌药的耐药率差别不大（见表1）。

表1 牛奶中金黄色葡萄球菌的耐药率

图2 牛奶中金黄色葡萄球菌耐药情况

4．2 金黄色葡萄球菌的多重耐药性 39株牛源金黄色葡萄球菌中没有0耐菌株出现，1耐和8耐各有1株，无2耐及8耐以上菌株。分离菌株都具有多重耐药性，主要集中在4耐～5耐，占总分离菌株的61．54%。

4．3 结果分析 食源性致病菌的耐药性对食品安全及人类健康的影响已经引起很多国家的重视。金黄色葡萄球菌的耐药性也呈多重化趋势，本次调查中39株金黄色葡萄球菌对磺胺类药物和青霉素的耐药率高达90%以上，对氨苄西林的耐药率也达89%以上，在13种抗生素中有10种抗生素存在不同程度的耐药现象，生鲜牛奶中金黄色葡萄球菌的耐药性可能与奶牛在饲养过程中食入添加抗生素的饲料有关，因此，控制饲料中抗生素的安全使用量尤为重要，是降低食源性致病菌耐药性发生的主要措施之一。

图3 牛奶中金黄色葡萄球菌多重耐药情况

金黄色葡萄球菌对药物的适应性较强，耐甲氧西林和耐万古霉素金黄色葡萄球菌都是超级耐药菌［4］。污染耐药性金黄色葡萄球菌的动物性食品是导致人类感染的原因［5］，因此，为防止耐药性金黄色葡萄球菌引起的危害，有必要对其进行耐药性监测，保障人类健康。

5 金黄色葡萄球菌毒素基因分型

设计SEA、SEB、SEC、SED、SEE、SEG、SHH、SEI和SEJ共9对引物，用PCR方法对分离鉴定的39株金黄色葡萄球菌进行毒素基因分型。引物序列及产物长度见表2，反应体系见表3。

表2 引物序列及产物长度

PCR的反应程序：先94℃预变性5min，再94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，共进行35个循环；最后72℃终延伸10min。反应完成后4℃保存。

表3 PCR反应体系

结果表明，39株菌株中，检测到SEA－SAJ基因的有36株，占92．3%，同时携带2种及以上毒素基因的菌株有27株，占69．2%。带有SEI肠毒素基因的最多，有32株，占82．1%。同时，也携带着其他肠毒素基因：SEA有16株，占41．0%；SEB有3株，占7．7%；SEC有2株，占5．1%；SED有3株，占7．7%；SEE有1株，占2．6%；SEG有7株，占17．9%；SEH 有12株，占30．8%；SEJ有5株，占12．8%。

［1］ 刘冬香，刘书亮，王印，等．四川省动物性食品中金黄色葡萄球菌的分离鉴定及污染分析［J］，食品科学，2009，30（8）：251－254．

［2］ 张兰荣，王连秀，张文得．食品中金黄色葡萄球菌的污染状况及耐药性分析［J］．中国食品卫生杂志，2004，16（1）：35－36．

［3］ 徐勤，巢国祥．生牛奶中金黄色葡萄球菌污染状况及耐药性状研究［J］．中国卫生检验杂志，2005，15（8）：972－973．

［4］ Jones T F，Kellum M E，Porter S S ，etal．An outbreak of community acquired foodborne illness caused by methicillin resistant Staphylococcus aureus［J］．Emerging Infectious Disease，2002，8：8284．

［5］ Lee J H．Methicillin （oxacillin）－resistant Staphy lococcus aureus strains isolated from major food animals and their potential transmission to humans［J］．Applied and Environmental Microbiology，2003，69：6489－6494．