蟾酥注射液的急性和亚慢性毒性研究

钟舒红，胡庭俊，郝利华，赵 晖，邓彦宏，何家康

（1．广西大学动物科学技术学院，广西 南宁530005；2．中国兽医药品监察所，北京 海淀100081；3．吉林大学畜牧兽医学院，吉林 长春130062）

蟾酥为蟾蜍科动物中华大蟾蜍（Bufobufogargarizans Cantor）或黑眶蟾蜍（Bufomelanostictus Schneider）的干燥分泌物［1］，具有强心、抗肿瘤、抗疲劳、增强免疫力、镇咳等药理作用［2］。在人类医学，蟾酥主要用于防治恶性肿瘤、止痛麻醉治疗、抗感染治疗、防治白细胞减少症和治疗周围性面神经麻痹等［3］。在兽医临床，蟾酥常用于治疗猪白痢、猪破伤风、猪肺疫、猪喘气病和猪流行性感冒等［4］。蟾酥为《中华人民共和国药典》二零零零年版一部标注毒性的15味常用有毒中药之一，其中毒机理主要是蟾毒配基引起迷走神经过度兴奋，致房室传导阻滞和心率失常［5］。毒性强弱与特殊基因相关。蟾酥制剂的毒性因提取方法不同而有较大的差异［6－7］。蟾酥注射液为蟾酥经水提醇沉制备而得，主要有效成分为水溶性生物碱。本研究旨在考察蟾酥注射液的临床毒性作用，为蟾酥注射液的安全用药提供试验依据。

1 材料与方法

1．1 药品 蟾酥注射液，广西北斗星动物保健品有限公司提供，规格：10mL：蟾酥0．02g。

1．2 试验动物 Wistar大鼠，7、8周龄，雌雄各半，体重80～100g，购自吉林大学医学部实验动物中心，动物合格证号：081013006。试验期间饲喂大鼠全价颗粒料，室温控制在18℃～25℃，相对湿度为55%～65%，室内无对流风。

1．3 仪器 全自动血细胞分析仪（CELL－DYN400，美国雅培公司）；Technicon全自动生化分析仪（RA－1000，美国泰尔康公司）；轮转式切片机（YD－1508型，浙江金华益迪医疗设备厂）；电子分析天平（BS－210S型，北京赛多利斯天平有限公司）。

1．4 急性毒性试验 选取大鼠50只，随机分为5组，每组10只，雌雄各半，用药前6h禁食不禁水。在预试基础上确定各组大鼠用药量，相邻两组间剂量的公比级数K值为1．2。1～5组大鼠用药剂量分别为70、84、101、121、145mg／kg。生理盐水将药液稀释至合适的浓度并按10mL／kg体重的剂量腹腔注射。

1．5 亚慢性毒性试验 大鼠买回后适应性饲养1周，选用体重为80～100g的大鼠120只，称重随机分为4组，每组30只，雌雄各半。第1～3组为试验组，即 高 剂 量 组 （1／10LD50）、中 剂 量 组 （1／20 LD50）、低剂量组（1／40LD50），第4组为空白对照组。每天同一时间腹腔注射蟾酥注射液（10mL／kg体重），对照组给予相同体积的生理盐水，连续给药4周，再饲养2周作为恢复期，各组均采用相同的饲养管理方式。检测指标：（1）血常规及血清生化指标。试验的28d，各组以断头处死20只大鼠，全血作血常规检验，血清作生化指标检验。（2）脏器系数：肉眼观察各组组织脏器的病变后，称取主要脏器心脏、肝脏、肾脏、肺脏、脾脏、睾丸的湿重，根据脏器系数＝脏器湿重×100／体重，计算各脏器的脏器系数。（3）病理组织学观察：取高、中、低剂量组动物的各内脏器官，以甲醛固定，作组织切片，观察病理组织学变化。

1．6 数据统计分析 大鼠增重、血常规指标、血清生化指标、脏器系数均用单因子方差分析检验各组的差异性，并借助统计分析软件SPSS 16．0来完成。

2 结果

2．1 急性毒性试验 高剂量组动物出现的中毒症状主要表现为精神抑郁、很快进入麻醉状态，无前期兴奋，呼吸加深随后逐渐减慢，伏卧不起，直至死亡。剖检死亡大鼠各脏器，肝脏出现少量淤血、坏死点，肠系膜充血，其他被检脏器如心、脾、肺和肾未见异常。病理组织学检查发现，肝脏中央静脉有轻微充血，而肝索和静脉窦正常，肝细胞无异常变化。心脏、肾脏和肺脏等均未见明显病理变化。见表1和表2。

表1 蟾酥注射液经大鼠腹腔给药LD50剂量对数

表2 蟾酥注射液对大鼠增重的影响（Mean±SD，n＝30）

从表1可以看出，蟾酥注射液经腹腔给药，其LD50为102．65mg／kg，LD50的95% 的可信限为93．92mg／kg～112．21mg／kg。

2．2 亚慢性毒性试验

2．2．1 日常观察与增重情况 低剂量组大鼠在4周的给药期间，活动正常、毛发光润、摄食，饮水、粪便均正常，未发现中毒症状，动物无一死亡。高、中剂量组在长期连续给药4周后，部分大鼠出现中毒典型症状表现，如食欲不振、毛色晦暗、无光泽、精神委顿、粪便不成形等，在整个试验期间也未出现大鼠死亡。染毒后第14天和第21天，高、中剂量组增重与对照组比较差异有显著意义（P＜0．05），低剂量组与对照组比较差异不显著（P＞0．05），结果见表2。

2．2．2 血常规检查 高、中剂量组 WBC显著高于对照组（P＜0．05）；高剂量组大鼠PLT与对照组比较差异显著（P＜0．05），其他各组 WBC、红细胞（RBC）和PLT值等指标与对照组比较均无显著性差距（P＞0．05），见表3。

2．2．3 血清生化指标检查大鼠高、中、低剂量组ALB与对照组比较有显著性差异（P＜0．05）；高、中剂量组总胆红素（T－BIL）、尿素氮（BUN）、肌 酐（CREA）、胆固醇（CHOL）、甘油三酯（TG）与对照组比较差异显著（P＜0．05）。有关恢复期，除了高剂量组的BUN、CREA与对照组差异有显著外，高剂量组的其他指标以及中、低剂量组的各项指标与对照组比较差异不显著（P＞0．05），结果见表4和表5。

2．2．4 脏器指数 停药时，高、中剂量组雌、雄大鼠的肝脏系数比对照组大，并有显著性差异（P＜0．05）；高剂量组雌、雄大鼠的脾脏系数、高剂量组雌性大鼠的子宫系数以及高、中剂量组雌、雄大鼠的肾脏系数均比对照组小，并有显著性差异（P＜0．05）；其他均无显著性差异（P＞0．05），结果见表6。恢复2周后，高剂量组的肝脏系数比对照组大、肾脏系数比对照组小，并有显著性差异（P＜0．05），结果见表7。说明蟾酥注射液高、中剂量下可使肝脏肿大、肾脏萎缩，高剂量下可使脾脏和雌性动物的子宫萎缩。恢复期后中剂量组动物各脏器系数与对照组比较无显著性差异，说明上述副作用停药后可恢复，而高剂量组停药后肝、肾功能的恢复不佳。

表3 蟾酥注射液对大鼠血常规指标的影响（Mean±SD，n＝30）

2．2．5 病理学检查 当亚慢性毒性试验结束时（28 d），各组随机取大鼠10只进行病理剖检，发现高、中剂量组大鼠肝、脾、肾、雌性大鼠的子宫呈暗红色，无光泽感，部分器官有瘀血现象。

给药4周后，高剂量组有11只动物、中剂量组有4只动物肝组织出现轻度淤血和中度的炎性细胞浸润。恢复期后中剂量组动物肝被膜完整，肝实质正常，肝小叶界限可辨，肝血窦中有血细胞，细胞质中有较丰富的糖原，汇管区无炎性细胞，属正常肝；而高剂量组动物肝组织仍有轻度的炎性细胞浸润。给药4周后后，高剂量组有10只动物、中剂量组有3只动物肾脏组织出现萎缩和退行性变化。组织学检查发现有明显的肾小管坏死，部分小管结构紊乱较严重，空泡变性明显，有的出现间质灶性纤维化。恢复期后高、中剂量组动物肾小管结构较为清晰，形态正常，无异常病理表现。高剂量组病理学检查还发现部分大鼠脾脏、部分雌性大鼠子宫萎缩、增长受抑制等现象，但停药恢复期后能恢复正常。其他各组动物各脏器质地未见异常，组织学检查未见明显病变。

表4 蟾酥注射液对大鼠血清生化指标的影响 （Mean±SD，n＝30）

表5 蟾酥注射液停药恢复2周后大鼠血清生化指标的影响 （Mean±SD，n＝10）

表6 蟾酥注射液停药时大鼠主要脏器系数的影响 （Mean±SD，n＝20）

表7 蟾酥注射液停药恢复期后大鼠主要脏器系数的影响 （Mean±SD，n＝10）

3 讨论

蟾酥为《中华人民共和国药典》二零零零年版一部标注毒性的15味常用有毒中药之一［8］。蟾酥的毒性与其提取方法、活性成分的组成与含量有着密切的关系。贺石林等［6］研究蟾酥的不同制剂对小鼠的LD50：蟾酥粗制品为40mg／kg，醇提取物为208 mg／kg，水提取物为900mg／kg。金其泉等［7］测定蟾皮制剂的急性毒性，蟾皮制剂Ⅰ号（水溶性成分）临床用量的1 500倍小鼠尾静脉给药未见中毒；蟾皮制剂Ⅱ号（水脂混合成分）毒性较大，LD50静脉注射为3．81±0．22mg／kg，腹腔注射为26．27±0．3 mg／kg，说明蟾酥制剂工艺、不同的提取方法、不同的活性成分，LD50相差较大。本制剂蟾酥注射液为蟾酥经水提醇沉精制而成的注射液，主要成分为水溶性生物碱。试验结果表明，其LD50为102．65 mg／kg（以蟾酥计），该剂量为猪临床推荐用量（0．2 mg／kg体重）的513倍。表明蟾酥注射液按临床推荐剂量使用安全性较高。

亚慢性毒性试验结果表明，蟾酥注射液高、中剂量组在用药10d后采食量明显下降、体重增长缓慢。至试验结束时，与对照组比较增重差异明显。表明蟾酥注射液在较高剂量下［≥5．0mg／kg（以蟾酥计）］长期使用可影响动物的生长发育。

谷丙转氨酶和谷草转氨酶参与体内转氨基作用，它们反映蛋白质合成和分解代谢的状况，其在血液中的变化显示肝的健康状态。当细胞、线粒体受损时，ALT和AST逸出细胞进入血液，使其血液浓度升高，血液中ALT与AST活性升高［9］。因此，血清酶活性的升高表示机体组织器官受损［4］。试验结果表明，各给药组血清中ALT水平显著性（P＜0．05）高于对照组，结合病理剖检和组织切片检查，说明蟾酥注射液长期大剂量使用对肝脏有损害作用。

高、中剂量组BUN、CREA水平与对照组比较差异显著（P＜0．05），表明蟾酥注射液对肾脏功能也有一定的影响。病理剖检和脏器系数检查证实，肾脏组织出现萎缩和退行性变化。组织学检查发现有明显的肾小管坏死，部分小管结构紊乱较严重，空泡变性明显，有的出现间质灶性纤维化。

综上所述，蟾酥注射液其毒性作用的靶器官主要是肝脏和肾脏，出现肝脏肿大和肾脏萎缩等现象，以肝细胞肿胀、变性、增生、肾小管坏死为特征性病变。在恢复期末，对余下动物进行相同项目观察和检测，发现中、低剂量组未见明显毒性反应和病理变化，肝脏和肾脏功能恢复较好，表明该剂量（≤5．0 mg／kg）条件下药物对试验动物造成的损伤性病变是可逆的，不会产生延迟性毒性反应。而较高剂量（≥10．0mg／kg）的恢复效果不佳。

综上可以看出，蟾酥注射液大剂量长期应用时会对肝脏、肾脏造成轻微的炎症，提示在临床上应用时一定要注意剂量和疗程，以免起到负面的作用。

［1］ 余椿生．蟾酥［J］．食品与药品，2008，10（1）：73－75．

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［3］ 王玲华，宋克中．蟾酥临床应用近况［J］．中国现代应用药学杂志，2006，23（7）：618－620．

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［6］ 贺石林，季安国，彭芝配，等．山莨菪碱对抗蟾酥毒性的实验研究［J］．中药药理与临床，1985，（1）：203．

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