禽流感病毒H9亚型血凝抑制试验抗原国家参考品的研制

孙建宏，刘景利，胡井雷，张从禄，韩正博，戴志红，杨 帆，徐姗姗

(1．中国农业科学院哈尔滨兽医研究所哈尔滨维科生物技术开发公司，哈尔滨 150001;2．中国兽医药品监察所，北京 100081)

国家兽用生物制品标准物质是控制和确定兽用生物制品产品质量、校准验证检验仪器和方法是否准确的物质标准，是正确诊断传染病、准确监测免疫情况的物质基础。禽流感是我国重点防控的重大动物疫病，H9亚型流行很广泛［1－2］。目前禽流感诊断、免疫监测及其疫苗免疫效果评价中应用最广泛的方法是HI试验，但是我国尚无H9亚型诊断试剂的标准物质，严重影响了前后不同时期检测数据的一致性和不同实验室数据的可比性。近年各级实验室对禽流感标准物质的需求越来越多，因此研制禽流感病毒H9亚型血凝抑制试验抗原参考品尤为迫切。我单位在国家现行的禽流感病毒H9亚型血凝抑制方法基础上［3］，研制出了禽流感病毒H9亚型血凝抑制抗原国家参考品。

1 材料与方法

1．1 材料 A型禽流感病毒A/Chicken/Shanghai/10/01株(简称CKSH01株，H9N2)，由国家禽流感参考实验室鉴定、保管和供应。SPF鸡及SPF鸡胚均由哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供。

1．2 禽流感病毒H9亚型血凝抑制抗原标准品的制备 按照常规方法，将毒种接种SPF鸡胚，收获鸡胚液制备禽流感病毒H9亚型血凝抑制抗原半成品，经灭活、浓缩，进行无菌检验、效价测定后，按每瓶1 mL分装冻干，批号为200901。保护剂采用本课题研制的配方和配制方法。

1．3 抗原检验

1．3．1 物理性状、无菌检验、剩余水分测定和真空度测定 按文献方法［4］进行。

1．3．2 特异性检验 采用血凝抑制试验的方法［4］，用该抗原分别对禽流感病毒H5亚型、H7亚型和H9亚型阳性血清、鸡新城疫阳性血清、减蛋综合征病毒阳性血清进行血凝抑制试验。

1．3．3 抗原效价的定值 按照红细胞凝集试验96孔微量板法进行测定。抗原先进行10倍、20倍、80倍稀释，然后依次进行 320、400、480、560、640、720、800倍…依次递增80倍进行稀释。先由本实验室测定HA效价，再由7家具有资质且事先经过比对确认其定值能力相同的试验室，采用同一方法进行协作标定［5］。对该批参考品任抽2个样品，每个样品在不同时间段分别作3次独立测定，每个样品测定间隔不少于3 d。所获得的6个数据应按统计学方法检验异常值，如发现有异常值，应予标明，并补做一次测定。所有用于定值测量的计量器具/测量仪器需经检定或校准合格，并在有效期内［2］。汇总全部原始数据，考察测量数据分布的正态性。在数据服从正态分布或近似正态分布的情况下，将每个实验室的所测数据的平均值视为单次测量值，构成一组新的测量数据。剔除可疑值。计算出总平均值和标准偏差。当全部数据服从正态分布或近似正态分布情况下，也可视其为一组新的测量数据。剔除可疑值，再计算全部原始数据的总平均值和标准偏差［5］。

1．3．4 均一性检验 因冻干数量在500支以上，所以随机取样15支［5］。分别称量每支内容物的净重量，用统计学方法分析其均一性。

1．3．5 稳定性检验 抗原在 －20℃、4℃、37℃条件下保存，并定期进行HA价测定，每一时间均要进行2次重复测量，用统计学方法从统计上剔除可疑值，再计算每次的平均值，该值与定值的偏差应不大于标准偏差。

2 结果

2．1 物理性状、无菌检验、真空度测定结果 均符合规定。

2．2 剩余水分测定结果 4份样品的剩余水分含量分别为 1．89%、2．35%、2．56% 和 1．69%，均小于3%，符合规定。

2．3 特异性检验结果 表1结果表明，制备的抗原只能被H9亚型阳性血清所抑制，而对其他阳性血清均呈阴性反应。

表1 抗原特异性检验统计表

2．4 抗原效价的定值结果 协作标定结果见表2。汇总全部原始数据，考察全部测量数据分布的正态性。经描述性统计学分析，该批抗原血凝效价为1∶(460±80)，由于数据是非连续的，变异较大，适合看众数和中位数。众数和中位数都是1∶400，因此将HA效价定值为1∶400，即400 HAU/支。

表2 协作标定结果

2．5 均一性检验结果 随机抽取样品15支，用电子分析天平分别称量其净重量。描述性生物统计分析得出:样品重量均在0．112～0．13 g之间，平均数为0．123 g;CV为4．2%，均在95%正常值范围内，表明该批标准品装量均一。

2．6 稳定性检验结果 结果表明，该抗原在37℃条件下保存 3、7、14、21、28 d HA 价保持 1 ∶400 未下降，35d略降低到1∶256;4℃保存10d、1个月、3个月、4个月、5个月、6个月和－20℃保存1个月、2个月、6个月、12个月、18个月时HA价均未降低，保持在1 ∶400。

3 小结

本试验室研制的禽流感抗原各项指标经检测均合格，无菌、特异、均一、稳定，可以作为国家参考品。但根据标准物质的特殊要求，－20℃条件下的保存时间还需每年定期检测确定。

［1］ 李建丽，刘国英，张金花．H9亚型禽流感的流行特点及其疫苗市场分析［J］．兽医导刊，2010，(3):69 －71．

［2］ 景小冬，章振华，李 林，等．H9亚型禽流感病毒流行毒株交叉免疫攻毒保护试验［J］．中国畜牧兽医，2010，37(6):134 －137．

［3］ 禽流感病毒H9亚型血凝抑制试验抗原与阴、阳性血清制造及检验试行规程［EB/OL］．［2008 －03 －04］．http://2010jiuban．agri．gov．cn/xxgkxzsp/t20080304_1028224．htm

［4］ 中华人民共和国兽药典二O一O年版三部［S］．

［5］ 国家标准物质中心．一级标准物质技术规范(JJG1006－94)［S］．1994．