MTT法评价3种鸡腿菇多糖的体外抗肿瘤活性

李佳媚，刘娜女，孙润广

（陕西师范大学 物理学与信息技术学院，陕西 西安710062）

多糖在生物体的生长和发育方面起着非常重要的作用，由于多糖具有独特的生物、化学和物理特性，近年来对多糖的研究非常广泛，已有研究表明大部分中草药多糖都具有特异性抑制肿瘤细胞生长且相对毒性较低的特点［1］．目前对菌类多糖的研究也较多，许多专家学者的研究表明香菇多糖能显著的抑制癌细胞的生长［2－3］，除了香菇多糖外，许多真菌多糖都具有很好的生物活性．鸡腿菇作为一种药食兼用的真菌具有丰富的药用保健活性，已经有的研究表明：鸡腿菇中含有丰富的生物活性成分，如糖类和蛋白质等，鸡腿菇多糖具有抗氧化、降血压、防止肝硬化、提高免疫力、抗菌、抗肿瘤等功效［4－5］．

目前对植物多糖的研究非常广泛，有学者的研究表明超声提取的龙眼多糖的理化性质发生了改变，并且超声处理可引起多糖微观结构发生变化［6］，超声处理高直链玉米淀粉后多糖的分子量发生降解，黏性下降，水溶性升高［7］；许多学者的研究表明硫酸化修饰后的多糖的抗肿瘤活性明显增强［8－9］，文献［10］报道等对平菇多糖进行硫酸化修饰后多糖对肿瘤细胞的抑制作用显著且呈现出剂量依赖效应．文献［11］研究发现硫酸酯化修饰的多糖对HepG2细胞的入侵与迁移有抑制作用并且具有剂量依赖效应；对多糖进行羧甲基化修饰也会使多糖的结构性质等发生改变［12］．因此对多糖进行不同的化学方法处理会影响多糖的理化性质及生物活性．本实验采用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法［13－14］评价超声辅助提取鸡腿菇多糖经季铵盐沉淀分级得到的碱性组分（UCP－3）、经过硫酸酯化修饰的鸡腿菇多糖（SWCP）和经过羧甲基化修饰的鸡腿菇多糖（CWCP）对人白血病K562细胞的体外增殖的影响作用，并分析比较不同的提取方法和化学修饰对鸡腿菇多糖体外抗肿瘤活性的影响．

1 材料与方法

1．1 材料与试剂

1．1．1 材料 鸡腿菇相关多糖WCP、UCP－3、SWCP、CWCP，由陕西师范大学生物物理与生物医学工程研究室制备；K562细胞来自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心．

1．1．2 试剂 主要试剂包括：无支原体新生牛血清，浙江天杭生物科技有限公司；RPMI Medium 1640，美国Gibco公司；MTT，美国Amresco公司；DMSO；医用酒精；其他试剂均为国产分析纯试剂；实验所用水均为三次蒸馏水．

1．2 仪器

Olympus TH4－200倒置显微镜，日本奥林巴斯公司；HH．CP－01W型二氧化碳细胞培养箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；YP601N电子天平，上海精密科学仪器有限公司；TDL80－2B台式离心机，上海安亭科学仪器厂；DG5032型酶联免疫检测仪，南京华东电子集团医疗仪器设备有限责任公司；SZ－97自动三重纯水蒸馏器，上海亚荣生化仪器厂；CF16RX高速离心机，日本日立公司．

1．3 实验方法

1．3．1 鸡腿菇相关多糖的制备方法 鸡腿菇相关多糖的制备具体过程如下：

（1）鸡腿菇多糖WCP制备：鲜鸡腿菇烘干粉碎后称重，加4倍体积80%乙醇脱脂（20min，3次），之后抽滤烘干并称重，加10倍体积水沸水浴煮2．5 h，重复3次，室温下4 000r／min离心10min，上清液经真空浓缩后醇沉，沉淀透析3d，冷冻干燥后即得沸水浴法提取鸡腿菇多糖WCP．

（2）超声提取鸡腿菇多糖UCP－3制备：参照文献［15］的方法，鲜鸡腿菇烘干粉碎后称重，加4倍体积80%乙醇脱脂（20min，3次），之后抽滤烘干并称重，加10倍体积水后超声波提取15min（每次10s、90次、间隔15s，功率300W）重复提取3次后室温下4 000r／min离心10min，上清液经真空浓缩后醇沉，沉淀透析3d，冷冻干燥后即得超声辅助法提取鸡腿菇粗多糖UCP，经季铵盐沉淀后取碱性组分UCP－3备用．

（3）硫酸酯化鸡腿菇多糖SWCP的制备：参照李国荣［16］等的方法．采用氯磺酸－吡啶法制备硫酸酯化鸡腿菇多糖，在酯化试剂体积比为V（氯磺酸）∶V（吡啶）为1∶3，反应温度保持在90℃，反应时间2h的条件下制备SWCP，保存备用．

（4）羧甲基化鸡腿菇多糖CWCP的制备：参照周瑞［17］等的方法．将0．5g鸡腿菇多糖溶解于38 mL质量分数为20%的NaOH溶液中，搅拌1h；然后加入溶有6g氯乙酸的异丙醇混合溶液50mL，保持55℃反应5h；停止反应冷却至室温，调节pH值为中性，透析3d；冷冻干燥即得CWCP，保存备用．

1．3．2 MTT法检测不同鸡腿菇多糖对K562细胞的体外增殖抑制活性 取处于对数生长期的状态良好的K562细胞，调整细胞密度为1×105个／mL接种到96孔板中，每孔100μL细胞悬液，放入37℃，5%二氧化碳和饱和湿度环境下培养24h后，调零孔和对照组每孔加入100μL无血清培养基溶液，实验组每孔分别加入100μL的WCP、UCP－3、SWCP和CWCP糖溶液（浓度分别为25、50、100、200和400μg／mL），每组做6个平行，继续分别培养24，48和72h后，每孔加入5mg／mL的MTT溶液20μL放入孵箱培养4h，1 000r／min离心5min，弃去上清液，每孔加入200μL的DMSO，轻微振荡15 min，用酶联免疫检测仪在492nm下测光吸收值OD．按照如下公式计算细胞增殖抑制率：细胞增殖

1．4 统计学分析

2 结果与分析

2．1 鸡腿菇多糖WCP对K562细胞体外增殖的作用

鸡腿菇多糖WCP体外对K562细胞的生长抑制作用观察结果见表1和图1．对不同浓度的鸡腿菇多糖WCP对K562细胞作用不同时间的MTT比色结果进行单因素方差分析，表明各组间没有显著性差异，由结果可知，鸡腿菇多糖WCP对K562细胞的生长几乎没有抑制作用．

表1 不同浓度WCP作用不同时间后MTT比色结果Tab．1 The MTT result of different concentration WCP at different time

图1 不同浓度WCP作用K562细胞24h，48h和72h后细胞增殖抑制率Fig．1 Inhibition ratio of K562cells after treated with WCP in different concentrations for 24h，48hand 72h

2．2 超声提取鸡腿菇多糖UCP－3对K562细胞体外增殖的作用

超声提取得到的鸡腿菇多糖UCP－3对K562细胞体外生长影响结果如表2和图2所示．从中可以发现超声提取鸡腿菇多糖UCP－3对K562细胞体外增殖具有抑制作用，在鸡腿菇多糖UCP－3浓度为25～100μg／mL之间及作用时间为24h时抑制作用没有显著性差异，其余浓度点和时间点的抑制作用均显著（P＜0．05或P＜0．01），随着多糖浓度和时间的增加抑制作用逐渐增强，具有浓度效应和时间效应，当超声提取鸡腿菇多糖UCP－3的浓度为400μg／mL和作用时间为72h时抑制效果最好，抑制率可达到27．90%（P＜0．01）．有学者研究表明超声波会改变多糖的空间结构［18－19］，超声波对多糖进行处理后会使多糖链中更多的官能团暴露，从而促进其生物活性的表达．刘娜女的研究表明UCP－3为分子量单一且不含糖醛酸、蛋白质、多肽和核酸等杂质的多糖，由此可说明超声提取的鸡腿菇多糖UCP－3是相对纯的生物多糖，排除了鸡腿菇中其他组分的干扰，具有抑制人白血病K562细胞体外增殖的活性．

表2 不同浓度UCP－3作用不同时间后MTT比色结果Tab．2 The MTT result of different concentration UCP－3at different time

图2 不同浓度UCP－3作用K562细胞24h，48h和72h后细胞增殖抑制率Fig．2 Inhibition ratio of K562cells after treated with UCP－3in different concentrations for 24h，48hand 72h

2．3 硫酸酯化鸡腿菇多糖SWCP对K562细胞体外增殖的作用

硫酸酯化修饰的鸡腿菇多糖SWCP对K562细胞的体外生长影响结果如表3和图3所示．鸡腿菇多糖经过硫酸酯化修饰后对K562细胞的体外增殖表现出明显的抑制作用，并且随着多糖浓度和时间的增加抑制作用逐渐增强，具有浓度效应和时间效应．单因素方差分析结果显示硫酸酯化鸡腿菇多糖对K562细胞的体外增殖抑制除浓度为25μg／mL与作用时间24h时不具有显著性差异外，其余作用点均表现出显著性差异（P＜0．05或P＜0．01），当硫酸酯化鸡腿菇多糖的浓度为400μg／mL和作用时间为72h时它对K562细胞的体外生长抑制率最高可达到38．95%．多糖的生物活性与其结构和理化性质紧密相关，多糖硫酸酯化修饰后由于所带硫酸基团的空间位阻和静电排斥效应改变了多糖原来的空间结构，增加了糖链的屈伸度，提高了水溶性，从而引起生物活性的改变［20］．硫酸酯化多糖处理癌细胞使细胞膜损坏或裂解成碎片，细胞浆浓缩和诱导细胞出现早期凋亡［21］，从而抑制肿瘤细胞的生长．

表3 不同浓度SWCP作用不同时间后MTT比色结果Tab．3 The MTT result of different concentration SWCP at different time

图3 不同浓度SWCP作用K562细胞24h，48h和72h后细胞增殖抑制率Fig．3 Inhibition ratio of K562cells after treated with SWCP in different concentrations for 24h，48hand 72h

2．4 CWCP对K562细胞体外增殖的作用

羧甲基化修饰的鸡腿菇多糖CWCP对K562细胞的体外生长影响结果如表4和图4所示．羧甲基化鸡腿菇多糖对K562细胞的体外增殖抑制在每个作用点均具有显著性（P＜0．01），鸡腿菇多糖经过羧甲基化修饰后对K562细胞的体外增殖表现出抑制作用，随着多糖浓度的升高抑制作用逐渐增强，随着作用时间的增加抑制作用逐渐减弱，魏文青等［22］的研究表明肿瘤药物对肿瘤细胞的生长具有一个最佳的作用时间，在最佳作用时间之前随着作用时间的增加其抑制作用增强，超过这个最佳作用时间后抑制作用随着时间的增长而减弱．在羧甲基化鸡腿菇多糖的浓度为400μg／mL和作用时间为24h是抑制率最高可达到31．17%．目前已经有研究表明对多糖进行化学修饰有助于提高其生物学活性，羧甲基化多糖能够显著提高多糖的电负性和水溶性，进而增强多糖的生物活性［23］；此外化学基团的引入也可能会增强多糖的活性，使多糖产生新的活性，具体还有待进一步研究．

表4 不同浓度CWCP作用不同时间后MTT比色结果Tab．4 The MTT result of different concentration CWCP at different time

图4 不同浓度CWCP作用K562细胞24h，48h和72h后细胞增殖抑制率Fig．4 Inhibition ratio of K562cells after treated with CWCP in different concentrations for 24h，48hand 72h

3 小结与讨论

对3种不同的鸡腿菇多糖的体外抗肿瘤活性进行了研究，结果表明对多糖采用不同方法提取与化学修饰会影响多糖的体外抗肿瘤活性，并且影响效果不同，化学修饰后多糖的抗肿瘤活性有所提高，这与很多文献报道一致．由此可见对鸡腿菇多糖进行不同的提取方法和修饰手段处理后其体外生物活性会发生变化．多糖作为一种有效的功能成分，副作用少，多种功效已经被证明，本试验通过对鸡腿菇多糖进行不同的处理和结构修饰后研究其体外抗肿瘤活性，为开发高效、低毒的多糖类抗肿瘤药物提供一定的实验依据．

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