化浊解毒方对胰岛素抵抗大鼠脂联素及胰岛素敏感指数的影响

章清华 吴深涛 周 祥 闫冬雪 史翠娟 周 静

（天津中医药大学第一附属医院，天津 300193）

近年来，糖尿病的发病率及患病率逐年升高，胰岛β细胞分泌缺陷和胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）是糖尿病的重要病理生理基础。脂联素是新近发现由脂肪组织特异分泌的具有重要功能的一个细胞因子，具有调节糖脂代谢，改善胰岛素抵抗，抗炎及抗动脉粥样硬化等作用，在延缓2型糖尿病及其慢性并发症的发生发展中起了重要作用。前期临床研究表明化浊解毒法及方药——化浊解毒颗粒在对抗糖、脂毒性相关IR方面疗效确切[1]，本研究通过观察化浊解毒方药对胰岛素抵抗大鼠的干预作用，进一步探讨其对脂联素及胰岛素分泌的影响，明确部分作用机制。

1 实验材料

1.1 动物及饲料 6周龄雄性SPF级SD大鼠，中国医学科学院医学动物研究所提供。普通饲料由华荣科技有限公司提供，高脂饲料依照文献[2]配制，即普通饲料中加入20%的脂肪（50%猪油和50%蛋黄粉）和20%蔗糖。

1.2 药物及试剂 化浊解毒方颗粒（组成：黄连15g、大黄6g、姜黄 15g、僵蚕 6g、蝉蜕 6g、枳实 20g、清半夏 10g、柴胡15g、白芍 20g、黄芩 15g、干姜 5g、佩兰 20g），由天津中医药大学第一附属医院药厂制备，批号101003，实验时用蒸馏水配制成所需浓度的溶液。链脲佐菌素（STZ）购自美国Sigma公司；高纯总RNA快速提取试剂盒（离心柱型）购自北京百泰克生物技术有限公司；Prime ScriptRT reagent Kit，perfect Real Time试剂盒与SYBRPremix ExTaqTMⅡ （perfect Real Time）试剂盒均购自宝生物工程（大连）有限公司，PCR引物由宝生物工程（大连）有限公司设计并合成；脂联素ELISA试剂盒购自美国invitrgeon公司，胰岛素放免试剂盒购自中国原子能科学研究院同位素研究所。

2 实验方法

2.1 实验动物与分组 选取6周龄雄性SD大鼠，适应性喂养1周，高脂饲料喂养10周后，按25mg/kg体重的剂量一次性尾静脉注射STZ（溶于0.1mmol/L柠檬酸缓冲液，pH4.4）。造模成功的标准为：于注射72h后禁食12h，用20%葡萄糖溶液2g/kg灌胃，0和120min血糖分别大于7.0和11.1mmol/L。将造模成功的大鼠随机分为化浊解毒方组、模型组，每组16只。空白对照组大鼠始终以普通饲料喂养。

2.2 给药方法 化浊解毒方组予化浊解毒颗粒按生药3g/（kg·d）灌胃给药，模型组与空白对照组灌服生理盐水，连续处理8周。

2.3 血清采集及观察指标 各组大鼠在灌胃治疗前目内眦静脉丛取血，治疗8周后经腹主动脉取血。检测空腹血糖（FBG）、血浆胰岛素（INS）、甘油三酯（TG）、胆固醇（CHOL）、脂联素 （aiponectin，APN）， 计算胰岛素敏感指数（insulin sensitive index，ISI）。空腹血糖、甘油三酯及胆固醇采用全自动生化分析仪检测；血清胰岛素采用放免法测定，其中ISI＝Ln［1/（FBG×FINS）］。

2.4 APN mRNA水平检测 提取肝脏组织总RNA，逆转录合成cDNA，以实时相对定量聚合酶链反应检测肝脏组织中APN mRNA水平。按SYBRPremix ExTaqTMⅡ试剂盒要求对APN与GAPDH基因体外扩增。APN引物序列为上游引物 ：5′GGAAACTTGTGCAGGTTGGATG 3′；下游引物：5′GGGTCACCCTTAGGACCAAGAA 3′； 扩增片段长度 141bp。内参照GAPDH引物序列为上游引物：5′GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG3′；下游引物 ：5′ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA 3′；扩增片段长度 143bp。 每个样品APN、GAPDH基因同时检测3个复孔，取平均值。

2.5 统计学方法 采用SPSS15.0软件进行统计分析，计量资料数值以（）表示，多组间资料比较用单因素方差分析。

3 实验结果

3.1 各组大鼠经处理后血糖、胰岛素、甘油三酯、总胆固醇变化 治疗后，化浊解毒方组大鼠血糖、胰岛素、甘油三酯、总胆固醇均低于模型组，但均高于空白对照组；胰岛素敏感指数化浊解毒方组高于模型组，低于空白对照组；除胰岛素敏感指数外，模型组各指标均高于空白对照组。见表1。

3.2 各组大鼠经处理后血清脂联素水平 治疗后，化浊解毒方组血浆脂联素水平高于模型组，但低于空白对照组，模型组脂联素水平远低于空白对照组，见表2。

3.3 化浊解毒方组与模型组APN mRNA表达水平的比较治疗后化浊解毒方组肝脏组织APN mRNA水平 （相对拷贝数）高于模型组，见表3。

4 讨论

浊毒是导致2型糖尿病发病的重要因素，并贯穿糖尿病病变之始终[3-5]，对应的化浊解毒法及方药在前期临床研究证明其在抗糖、脂毒性相关IR方面疗效确切。该方以古方升降散化裁，清代医家杨栗山谓其“盖取僵蚕、蝉蜕升阳中之清阳，姜黄、大黄降阴中之浊阴，一升一降，内外通和，而杂气之流毒顿消矣”（《寒温条辨》卷四）。更以黄连清胃肠之热，合大黄为君清热解毒，荡涤浊邪；加柴胡、黄芩为臣清利少阳，泻肝胆而疏理脾胃；白芍柔肝敛阴，辅佐以不伤阴；枳实理气导滞行浊；清半夏降浊合黄连辛开苦降，疏畅中焦；佩兰和胃化浊消脾瘅，干姜辛温以暖中焦，两者相合亦制他药之苦寒。全方共奏化浊解毒、清肝和胃之功。

IR是2型糖尿病发病机制的关键环节之一，改善IR是预防和治疗2型糖尿病的重要手段。APN是近年来发现的一个重要的脂肪细胞因子。众多研究显示APN是调控IR的重要因素，也是IR的重要生物标记物[6-7]。

本研究结果表明，化浊解毒方组有效降低了血浆胰岛素水平，提高了胰岛素敏感性。肝脏是胰岛素抵抗的重要靶器官，我们在研究中观察了肝脏组织的APN mRNA水平，发现模型组肝脏组织APN mRNA水平较空白对照组大为降低，这提示肝脏组织APN mRNA水平和血浆APN水平一样，都能有效反映机体的IR水平。经过化浊解毒方治疗后，肝脏组织APN mRNA水平较前明显升高，这提示化浊解毒方改善IR机制可能与提高肝脏组织APN mRNA水平有关。我们同时观察了模型鼠体内脂代谢的状况，发现模型鼠血脂谱与正常鼠相比表现出了明显的紊乱，而经过化浊解毒方治疗后，血脂则显著降低。提示化浊解毒方很可能是通过提高APN水平而改善脂代谢紊乱。

虽然众多研究显示APN是改善IR的重要因素，并作为IR的标记物受到重视，但也有人认为，APN降低可能是机体IR导致的结果，而不是原因[8]。虽然关于APN与IR的因果关系尚存争议，但对于血浆和肝脏组织APN水平反映IR程度仍是目前的共识。

表1 各组大鼠血糖、胰岛素、甘油三酯、总胆固醇水平及ISI（）

表1 各组大鼠血糖、胰岛素、甘油三酯、总胆固醇水平及ISI（）

注：与空白对照组比较，△P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.01。

表2 各组大鼠血清脂联素水平（）

表2 各组大鼠血清脂联素水平（）

注：与空白对照组比较，△P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.01。

表3 各组大鼠APN mRNA水平（）

表3 各组大鼠APN mRNA水平（）

注：与模型组比较，**P＜0.01（模型组相对拷贝数为 1）；#ΔΔct=（化浊解毒方组目的基因ct值-化浊解毒方组内参基因ct值）-（对照组目的基因ct值-对照组内参基因 ct值）；▲相对拷贝数=2-△△ct。

综上，化浊解毒方可提高IR大鼠肝脏组织和血浆APN水平，改善大鼠的IR，改善糖、脂代谢紊乱，其具体防治糖尿病作用机制仍有待进一步研究。

[1]吴深涛，武娜杰，张罡，等.化浊解毒法对2型糖尿病葡萄糖毒性作用的临床观察.天津中医药，2005，22（2）：11

[2]周迎生，高妍，李斌，等.高脂喂养联合链脲佐菌素注射的糖尿病大鼠模型特征.中国实验动物学报，2005，13（3）：154

[3]吴深涛.糖尿病中医病机新识.中国中医基础医学杂志，2005，11（11）：808

[4]吴深涛.论浊毒与糖尿病糖毒性和脂毒性的相关性.中医杂志，2004，45（9）：647

[5]吴深涛，闫冬雪.从浊毒论糖尿病血脂异常之防治.中华中医药杂志，2009，24（8）：1047

[6]Stefan N，Stumvoll M，Vozarova B，et al.Plasma adiponectin and endogenous glucose production in humans.Diabetes Care，2003，26（12）：3315

[7]周强，黄汉莲，周芸，等.广州地区2型糖尿病人群脂联素SNP＋45基因型与胰岛素抵抗水平的研究.实用医学杂志，2010，26（2）：316

[8]Cook J R，Semple R K.Hypoadiponectinemia-cause or consequence of human ＂insulin resistance＂.J Clin Endocrinol Metab，2010，95（4）：1544