CCL20抗体对慢性阻塞性肺疾病大鼠外周血和肺泡灌洗液中树突状细胞表面因子表达的影响

顾延会，欧阳瑶，孙得胜（遵义医学院附属医院呼吸一科，贵州 遵义 563003）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是气道慢性非特异性炎症性疾病。研究认为多种细胞因子、趋化因子、蛋白酶和氧化剂等参与COPD炎症过程。CC亚族趋 化 因 子 配 体 20（CC chemokine ligand－20，CCL20）是CC家族的趋化因子，主要表达于炎症组织上皮表面，包括气道上皮。国内外研究报道中均提示树突状细胞（dendritic cells，DCs）参与COPD发病过程，作为DCs最强有力的趋化因子——CCL20亦可能参与了COPD的发病过程，可能是通过影响DCs在气道内的募集而参与该过程。本研究制备CCL20抑制型大鼠模型，研究CCL20和DCs在COPD发病过程中的作用及抗CCL20抗体治疗对外周血和肺泡灌洗液（brochoalveolar lavage fluid，BALF）中 DCs表面因子表达的影响，以期进一步认识CCL20在COPD发病机制中的作用，从而为COPD的治疗提供一个新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物、材料与仪器 雄性SPF级Wistar大鼠（由重庆第三军医大学大坪医院实验动物中心提供）48只，约8周龄，体质量（200±20）g；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）及E.coli 055∶B5购自美国Sigma公司；MIP－3α（G－20）购自Santa公司；大鼠巨噬细胞炎性蛋白3α（MIP－3α／CCL20）酶联免疫分析试剂盒由美国B＆D公司生产，上海西塘生物科技有限公司提供；PE anti－rat CD80（B7－1）、 PE Mouse IgG1、k Isotype control、FITC anti－rat CD86（B7－2）、FITC Mouse IgG1、APC anti－rat MHC ClassⅡ及APC Mouse IgG1均购自eBioscience公司；Anti－OX－62Monoclonal Antibody、 Mouse IgG1k Isotype control PE均购自Thermo Science公司；Monoclonal Anti－rat CCL20／MIP－3α Antibody 购自R＆D Systems公司。流式细胞检测仪购自美国B＆D公司。

1.2 动物分组及模型制备 48只 Wistar大鼠饲养于遵义医学院药理学教研室动物房内（符合饲育SPF级实验动物），饲养温度25℃，相对湿度70%，昼夜照明12h／12h。按随机数字表法分为正常对照组（n＝16）、COPD模型组（n＝16）和CCL20抑制组（n＝16）。参考文献［1］制备动物模型，COPD模型组及CCL20抑制组大鼠第1和15天气道内注入LPS溶液0.2mL（200μg／200μL），第2～28天（第15天除外）连续每天被动吸烟2次，30min×12支／次；另外，CCL20抑制组大鼠第1天注LPS前腹腔注射CCL20单克隆抗体［2］（100μg／只）；正常对照组大鼠正常喂养，不加任何干预措施。各组大鼠于第28天，清醒状态下，取内毗球后静脉丛血液1mL置于EDTA抗凝管，即为外周血标本；开胸后立即结扎右肺，取右肺下叶组织约1cm×1cm×1cm大小用于病理切片；左肺经支气管肺泡灌洗留取BALF。

1.3 ELISA法检测血清上清液和BALF中CCL20含量 应用ELISA法测定血清和BALF中CCL20含量，测定方法按试剂盒说明书进行。

1.4 流式细胞术（FCM）检测血浆和BALF中DCs表面因子CD80、CD86、OX－62及MHC－Ⅱ的表达血浆和BALF标本加荧光抗体，室温避光25min，PBS漂洗2次，加固定液至200μL，上机。FCM测定由遵义医学院附属医院细胞工程室专人操作。

1.5 统计学分析 采用SPSS 13.0统计学软件包进行统计分析。计量资料数据均以表示。外周血和BALF中CD80、CD86、OX－62和CCL20含量及外周血MHC－Ⅱ表达水平3组间比较均采用单因素方差分析（One－way ANOVA）。外周血中CCL20、CD80、CD86、OX－62和MHC－Ⅱ表达水平及BALF中CCL20含量3组间方差齐，两两比较采用LSD检验；BALF中CD80、CD86和OX－62表达水平3组间方差不齐，两两比较采用Dunnett法。

2 结 果

2.1 3组大鼠一般情况及其肺组织病理学改变正常对照组：大鼠毛发有光泽，活泼好动，呼吸平稳，体质量增加迅速，无死亡。镜下见气管表面纤毛排列整体，未见腺体及炎性细胞浸润；肺泡结构正常连续，肺泡壁完整。COPD模型组：大鼠毛发逐渐失去光泽，神情倦怠，活动减少，体质量基本上无增加，反而下降，第7天开始出现喷嚏、倦怠及呼吸加深症状，且随着造模时间增加，上述症状逐渐加重，稍动即视其气促。造模过程中COPD组大鼠死亡4只。镜下可见大鼠支气管黏膜上皮脱落，管壁及周围大量单核细胞和淋巴细胞浸润，管腔内腺体增生，肺泡结构紊乱，肺泡壁变薄或断裂，肺泡腔扩大，部分融合成肺大疱。见图1A（插页一）。CCL20抑制组：与正常对照组比较，逐渐出现咳、喘、气促等症状，体质量稍有下降；但与COPD组大鼠比较，咳、喘、气促症状减轻，体质量明显高于COPD组。造模过程中CCL20抑制组大鼠死亡4只。与COPD组比较，CCL20抑制组大鼠肺组织炎症和肺气肿减轻。见图1B（插页一）。

2.2 3组大鼠外周血及BALF中CCL20含量3组大鼠外周血和BALF中CCL20含量总体比较，差异均有统计学意义（F＝27.975和4.873，均P＜0.05）。与正常对照组比较，COPD组和CCL20抑制组大鼠外周血和BALF中CCL20含量均升高（均P＜0.05）；与COPD组比较，CCL20抑制组大鼠外周血CCL20含量无明显改变，差异无统计学意义（P＞0.05），但CCL20抑制组大鼠BALF中CCL20含量降低（P＜0.05）。见表1。

表1 3组大鼠外周血及BALF中CCL20含量Tab.1 The contents of CCL20in peripheral blood and BALF of rats in three groups ［，ρB／（ng·L－1）］

表1 3组大鼠外周血及BALF中CCL20含量Tab.1 The contents of CCL20in peripheral blood and BALF of rats in three groups ［，ρB／（ng·L－1）］

＊P＜0.05compared with control group；△P＜0.05compared with COPD group.

Group n CCL20content Peripheral blood BALF Control 1622.25±6.05 11.70±8.80 COPD 12 69.35±14.37＊ 40.48±19.22＊CCL20inhibited 12 68.71±18.02＊ 32.04±10.52＊△

2.3 3组大鼠外周血中CD80、CD86、OX－62和MHC－Ⅱ的表达水平 3组大鼠外周血中CD80、CD86、OX－62和MHC－Ⅱ百分比总体比较，差异均有统计学意义（F＝4.203、3.887、20.746和12.114，均 P＜0.05）。与正常对照组比较，COPD组大鼠外周血中CD80、CD86和OX－62百分比均升高（均P＜0.05），MHC－Ⅱ百分比降低（P＜0.05）；CCL20抑制组大鼠外周血CD80百分比升高（P＜0.05），MHC－Ⅱ百分比降低（P＜0.05），CD86和OX－62百分比差异无统计学意义（均P＞0.05）；与COPD组比较，CCL20抑制组大鼠外周血CD86和OX－62百分比均降低（均P＜0.05），CD80和MHC－Ⅱ百分比差异无统计学意义（均P＞0.05）。见表2。

表2 3组大鼠外周血中CD80、CD86、OX－62和MHC－Ⅱ的百分比Tab.2 The percentages of CD80，CD86，OX－62and MHC－Ⅱin peripheral blood of rats in three groups （，η／%）

表2 3组大鼠外周血中CD80、CD86、OX－62和MHC－Ⅱ的百分比Tab.2 The percentages of CD80，CD86，OX－62and MHC－Ⅱin peripheral blood of rats in three groups （，η／%）

＊P＜0.05compared with control group；△P＜0.05compared with COPD group.

Group n CD80 CD86 OX－62 MHC－ⅡControl 16 25.06±1.63 11.33±0.80 5.62±1.40 33.13±3.76 COPD 12 30.77±3.44＊ 14.09±2.60＊ 10.54±1.13＊ 21.73±5.75＊CCL20inhibited 12 29.39±4.82＊ 11.23±3.54△ 5.32±2.05△ 22.31±3.72＊

2.4 3组大鼠BALF中CD80、CD86、OX－62和MHC－Ⅱ的表达水平 3组大鼠BALF中CD80和CD86百分比总体比较，差异均有统计学意义（F＝4.265和6.738，均P＜0.05），OX－62百分比比较差异均无统计学意义（F＝1.544和0.045，均P＞0.05）。与正常对照组比较，COPD组和CCL20抑制组大鼠BALF中CD80和CD86百分比升高（均P＜0.05）。与COPD组比较，CCL20抑制组大鼠BALF中CD80百分比降低（P＜0.05），CD86百分比差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 3组大鼠BALF中CD80、CD86和OX－62的百分比Tab.3 The percentages of CD80，CD86，OX－62and MHC－Ⅱin BALF of rats in three groups（，η／%）

表3 3组大鼠BALF中CD80、CD86和OX－62的百分比Tab.3 The percentages of CD80，CD86，OX－62and MHC－Ⅱin BALF of rats in three groups（，η／%）

＊P＜0.05compared with control group；△P＜0.05compared with COPD group.

Group n CD80 CD86 OX－62 Control 16 0.36±0.26 0.74±0.09 0.62±0.68 COPD 12 1.39±0.69＊ 1.64±0.67＊ 0.57±0.46 CCL20inhibited 12 0.85±0.24＊△ 1.33±0.25＊0.48±0.09

3 讨 论

COPD是一种可防和可治的疾病，与肺脏对吸入的有害颗粒或气体产生的异常炎症反应有关。目前关于 COPD与 DCs、CCL20／CCR6关系的研究［3－4］较多。人体研究［5］发现：COPD 患者气道内DCs及CCL20的含量明显增加，且与疾病的严重程度呈正比，2009年本课题组在对COPD患者的研究［6］中得到了一致的结果。动物研究［7］发现：CCR6基因缺陷鼠BALF中DCs的数量减少，CCL20蛋白含量也明显下降，肺组织炎症和肺气肿较COPD鼠减轻，提示CCL20／CCR6相互作用对于DCs的募集起重要作用。CCL20是CC家族的趋化因子，是DCs最强有力的趋化因子。当吸烟等有害物质侵袭肺脏时，CCL20在DCs迁移到局部淋巴结的过程中起到了重要的趋化作用。经抑制CCL20活性能否减轻炎症反应的发生，从而延缓COPD进展，对此本文作者进行关于CCL20抗体抑制CCL20活性，从而影响DCs在COPD发病中作用的研究。

COPD动物模型的建立方法众多，目前被动吸烟联合气道内注入LPS法已经成为最为常见的造模方法，多项研究结果证实这种COPD大鼠的细胞学、组织病理学及肺功能均符合人类COPD的特征，可用于人类COPD发生发展的研究。本研究组通过此方法亦建立符合人类COPD的病理改变的动物模型［8］。在此模型建立成功的基础上，本文作者进一步研究应用CCL20单克隆抗体的CCL20抑制型COPD动物模型，实验中病理结果显示：与COPD组比较，CCL20抑制组大鼠肺组织炎症和肺气肿减轻，表明CCL20抗体对COPD的气道炎症及病理损害过程可能有一定的抑制作用［9］。造模过程中，在气道内注 LPS操作时COPD模型组及CCL20抑制组大鼠均有死亡，可能与该操作过程中LPS溶液紧急吸入呼吸道和肺泡内引起的窒息有关。

本研究结果显示：COPD组大鼠外周血及BALF中CCL20含量及DCs百分比较正常组增多，与前期人体研究结果相符。与正常对照组比较，COPD组和CCL20抑制组大鼠外周血CCL20的含量明显增加，这可能与实验中LPS的刺激有关［10］，但CCL20抑制组大鼠BALF中CCL20含量低于COPD组，提示CCL20可能参与了COPD的发病过程。

与正常对照组比较，COPD组大鼠外周血中CD80、CD86和OX－62百分比均升高，提示COPD发病过程中由造血组织到达外周血中的DCs含量增加，有利于DCs募集到COPD气道组织，但MHC－Ⅱ降低，可能与测定时其不能被荧光抗体有效识别，或者COPD可能导致其过早凋亡有关，故在BALF中将不作为研究指标；与COPD组比较，CCL20抑制组大鼠外周血CD86和OX－62百分比降低，提示应用CCL20单克隆抗体可以减轻COPD外周血中DCs的增加，有助于减轻DCs在COPD气道内的募集。与正常对照组比较，COPD组大鼠BALF中CD80和CD86百分比升高，提示COPD气道内DCs增加，气道损伤严重，进而导致COPD的发生。与COPD组比较，CCL20抑制组大鼠CD80百分比降低，但仍较正常对照组增高，提示应用CCL20单克隆抗体后，COPD气道内DCs的增加可以得到抑制。

CCL20单克隆抗体通过干扰CCL20的趋化作用，从而抑制CCL20／CCR6途径的激活，目前在结肠炎、乙型肝炎、变应性鼻炎、关节炎、呼吸道合胞病毒等疾病的研究［2，11－13］中较多，结果证实其拮抗作用较好。但本研究发现CCL20抗体并不能充分抑制气道内DCs的增加，且与COPD组比较，CCL20抑制组大鼠外周血中CD80及BALF中CD86并无显著性变化，这可能与模型中CCL20抗体剂量、注入时间及方式尚需摸索调整，以增强其抑制作用；也可能由于单纯采用CCL20抗体只能在一定程度上抑制CCL20的功能，并不能有效减少CCL20的产生有关。

总之，CCL20可影响DCs在COPD气道内的募集，CCL20单克隆抗体减轻了外周血和气道中DCs的增长，从病理结果来看，其对COPD的气道炎症及病理损害过程有一定的抑制或延缓作用。

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