RET基因多态性与甲状腺乳头状癌的关联性分析

王 崇，刘晓莉，史杰萍，吴燕华，王诗镔，于雅琴，孙 辉

（1.吉林大学公共卫生学院流行病与卫生统计学教研室，吉林 长春 130021；2.吉林大学中日联谊医院甲状腺外科，吉林 长春 130033）

甲状腺癌是最常见的内分泌系统恶性肿瘤，占机体所有恶性肿瘤的1%［1］，其主要包括乳头状癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）、髓 样 癌（medullary thyroid carcinoma，MTC）、滤泡状癌和未分化癌4种类型，其中以PTC最为常见［2］。甲状腺癌的发病机制至今尚未完全明确，有研究［3］表明：女性、亚洲人种、学历高、有甲状腺肿病史、颈部接受过放射线照射和有甲状腺疾病家族史是甲状腺癌的危险因素。也有研究表明：甲状腺癌的发生发展与某些基因及其基因的多态性有关，如RET原癌基因、TSHR基因、BARF基因和Ras基因等。Lönn等［4］和Ho等［5］已报道过 RET 基因多态性与PTC的发生有关。本研究采用病例对照的方法，通过检测RET基因外显子11上的rs1799939位点的基因多态性，探讨该单核苷酸多态性（SNPs）位点与PTC的关联性，为今后揭示甲状腺癌的发病机制提供一定的遗传学依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象 收集2010年1—5月在吉林大学中日联谊医院通过手术后病理切片确诊的100例PTC患者作为病例组，按年龄、性别、民族和地理位置匹配，选取同期在吉林大学第一医院进行体检的100例排除肿瘤及甲状腺相关疾病的健康人为对照组。研究对象均为中国北方汉族人群。所有PTC均依据《2009年美国甲状腺学会甲状腺结节和分化型甲状腺癌诊断治疗指南》确诊。

1.2 标本的采集及处理 在获取研究对象的知情同意后，抽取外周静脉血5mL，EDTA抗凝，－20℃冻存以备基因组DNA的提取。

1.3 基因组DNA的提取 利用微量DNA提取试剂盒（Promega公司，美国）提取DNA，采用紫外分光光度计（Beckman公司，美国）检测DNA含量，测定吸光度（A）值，A260／A280比值为1.6～2.0，提取出的DNA置于4℃冰箱保存。

1.4 引物设计 在NCBI的SNP数据库里下载RET基因rs1799939位点的模板序列，利用Primer Premier 5.0软件，按照引物设计原则设计1对引物。上游引物：5′－CACAAGCCACCCATCTCC－3′，下游引物：5′－GAACGGCACCTCATCATAGTC－3′，PCR产物片段长度为342bp。

1.5 基因型检测 采用PCR－RFLP方法进行基因型检测：①PCR反应体系及条件。反应体系为25μL，含有2×Tag混合DNA聚合酶（北京天根生物公司）12.5μL（0.1U），上、下游引物（大连宝生物公司）各1.0μL（10μmol·L－1），ddH2O（二馏灭菌水）8.5μL，模板DNA（25～35ng）2.0μL。反应条件：94℃预变性5min，94℃变性40s，58.3℃退火1min，72℃延伸1min，40个循环后72℃延伸10min。取PCR产物6μL，用1%琼脂糖凝胶电泳30min，电泳后用凝胶成像分析系统（Bio－Rad公司，美国）进行照相和保存。②酶切体系及反应条件。利用限制性内切酶BanⅠ对PCR扩增产物进行酶切。酶切体系为20μL，包括PCR扩增产物10μL，限制性内切酶BanⅠ1.0μL，10×Buffer 2.0μL，ddH2O 7.0μL。酶切体系在37℃恒温箱中酶切4～5h后，用2.5%琼脂糖凝胶电泳45min，凝胶成像分析系统观察酶切图谱，判断位点的基因型并照相保存。

1.6 统计学分析 采用SPSS 13.0统计软件进行数据的统计分析，应用拟合优度χ2检验分析病例组和对照组基因型分布是否符合Hardy－Weinberg平衡定律，以及该位点的基因型、等位基因频数分布与PTC的关联。

2 结 果

2.1 2组研究对象的基本情况 病例组100例，其中男性24例，女性76例，平均年龄为（42.02±8.96）岁。对照组100例，其中男性26例，女性74例，平均年龄为（43.03±10.12）岁，病例组和对照组的年龄、性别差异均无统计学意义（t＝0.747，P＝0.456；χ2＝0.107，P＝0.744），具有可比性。

2.2 PCR扩增和酶切结果 RET基因上rs1799939位点是呈二态性的SNP位点，有G和A 2种等位基因。PCR扩增产物基因片段长度为342bp。见图1。PCR产物经限制性内切酶BanⅠ消化后，可能产生2个酶切片段，长度分别为80和262bp。本研究检测出2种基因型，分别为G／G基因型（纯合切开）和G／A基因型（杂合切开），未发现A／A基因型（纯合未切开）。见图2。

2.3 Hardy－Weinberg遗传平衡检验 经拟合优度χ2检验，该位点病例组和对照组的基因型频数分布均符合 Hardy－Weinberg遗传平衡定律（P＞0.05）。见表1。

图1 rs1799939位点PCR扩增产物电泳图Fig.1 The electrophoregram of PCR amplification products of rs1799939site

图2 rs1799939位点限制性酶切产物电泳图Fig.2 The electrophoregram of RFLP products of rs1799939site

2.4 rs1799939位点与PTC的关联性分析 病例组和对照组G／G、G／A 2种基因型频数分布差异无统计学意义（χ2＝0.276，P＝0.599），G、A等位基因频数分布差异亦无统计学意义（χ2＝0.245，P＝0.621），ORGA／GG＝1.202（95%CI：0.604～2.393），ORA／G＝1.177（95%CI：0.616～2.250），rs1799939位点的多态性与PTC不存在关联。见表2。

表1 rs1799939位点的Hardy－Weinberg遗传平衡定律检验Tab.1 The goodness of fit chi－square test for the Hardy－Weinberg equilibrium of rs1799939site

2.5 rs1799939位点在不同性别PTC患者中的分布 按性别将病例组PTC患者分为男性、女性2组，进行基因型频数和等位基因频数的χ2检验，经检验，不同性别的PTC患者在rs1799939位点的基因型频数分布差异无统计学意义（χ2＝0.025，P＝0.874），G、A等位基因频数分布差异亦无统计学意义（χ2＝0.022，P＝0.882）。见表3。

表2 rs1999939位点基因型和等位基因频数分布Tab.2 Distribution of genotypic and allelic frequencies of rs1799939site ［n（η／%）］

表3 不同性别PTC患者基因型和等位基因频数分布Tab.3 Distribution of genotypic and allelic frequencies in PTC patients with different genders ［n（η／%）］

3 讨 论

近年来甲状腺癌的发病率呈增高趋势，世界各地女性患者的发病率均高于男性。据世界卫生组织国际癌症研究署（IARC，http：／／www.iarc.fr／）［6］报道，全球男性甲状腺癌发病率由2000年的1.2／10万增加到2008年的1.5／10万，女性由3.0／10万增加到4.7／10万，呈现逐年上升趋势。我国天津、上海、海门等城市的流行病学调查也显示甲状腺癌的发病率逐年增高［7－9］。

RET原癌基因最先由Takahashi等［10］发现。该基因位于人类染色体10q11.2，共含有21个外显子，全长60000bp，能够编码一种跨膜的酪氨酸激酶受体蛋白（RET蛋白），这种受体在神经嵴细胞系中表达，对细胞的正常生理功能有调节作用，同时该蛋白也与细胞之间的信号转导有关。目前国外已有研究报道RET基因多态性与甲状腺癌的发生存在关联。Lönn等［4］研究表明：RET基因rs1799939位点的多态性与PTC的发生有关，且这种关联性在年轻女性中表现更强。Elisei等［11］通过对106例健康人和106例MTC患者rs1799939位点基因型的检测发现MTC的发生与该位点存在关联性。2012年，Figlioli等［12］采用 Meta分析的方法也证实了rs1799939位点的多态性可以增加患甲状腺癌的风险。国内此类研究则较少。

本研究采用病例－对照研究方法，利用PCR－RFLP技术探讨RET基因第11外显子上rs1799939位点多态性与PTC的关系。分析结果表明：该位点的基因多态性与PTC的发生不存在关联，与不同性别的PTC患者的发病也不存在关联。这个结果与Ho等［5］的研究结果一致。本研究得到阴性结果的可能原因是：①样本量较小，选取位点单一，能够提供的信息量有一定限制，不足以得出有统计学意义的结果。有研究［13－14］表明：多个多态性位点联合作用时可以增加甲状腺癌的发病风险。②甲状腺癌的病因很多，可能在发病的过程中有多个基因联合作用，而每个基因所起的作用相对微小，因此在检验单个RET基因与甲状腺癌的关系时可能难以达到显著性水平。③甲状腺癌的发病机制尚未清楚，除了已知的RAF／MEK／ERK信号转导通路和PI3K／Akt信号转导通路外，可能还存在其他未知的通路起着重要的作用。④甲状腺癌的发生发展除了遗传因素外，还与环境因素有关，本研究未探讨环境因素的作用，可能会导致阴性结果。⑤由于本研究的研究对象与阳性结果的研究对象在地理位置、遗传背景、种族和生活环境等方面存在差异，也有得到阴性结果的可能。⑥本研究病例组的癌症病理类型为PTC，可能会与部分研究结果不一致。

综上所述，本研究虽未发现rs1799939位点的多态性与中国北方汉族人群PTC的易感性存在关联，但尚不能完全排除rs1799939位点在PTC发生中的作用。在今后的研究中，为了获得更为准确的结果，可以扩大研究的样本量，增加研究的多态性位点，同时检测多个与甲状腺癌的发生可能有关的基因，对相关资料进行单倍体型分析、基因－基因的交互作用分析、基因－环境的交互作用分析，进一步探讨甲状腺癌的发病机制。

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