肿瘤干细胞标记物ALDH1在非浸润性膀胱癌组织中的表达及其临床意义

张海涛，金美善，石爱平，卢 绩，许 宁，邵明明

（1.吉林大学第一医院泌尿外科，吉林 长春 130021；2.吉林大学第一医院病理科，吉林 长春 130021；3.吉林大学第一医院普外科，吉林 长春 130021）

膀胱癌是世界范围内常见的恶性肿瘤之一，发病率位居所有恶性肿瘤的第11位［1］，是我国泌尿系统最常见的恶性肿瘤。膀胱癌预后较差且容易复发。是临床上治疗失败的主要原因。近年国外研究［2］发现：肿瘤干细胞标记物乙醛脱氢酶1（aldehyde dehydrogenase 1，ALDH1）是鉴别膀胱癌干细胞的指标之一，ALDH1高表达提示膀胱癌预后较差，但ALDH1在非浸润性膀胱癌组织中的表达及其与临床病理和预后关系的研究，目前国外报道甚少，国内尚未见报道。本实验通过免疫组织化学方法检测非浸润性膀胱癌组织及癌旁正常膀胱组织中ALDH1的表达，并分析其与膀胱癌病理分级、分期、复发及预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2007年3月—2011年6月在吉林大学第一医院行膀胱癌手术治疗的患者118例蜡块标本，其中经尿道电切除患者107例，膀胱全切除患者11例，上述标本均经病理证实为非浸润性膀胱尿路上皮癌。其中男性89例，女性29例；年龄27～90岁，平均69.8岁；病理分级：低级别77例，高级别41例；病理分期：pTa 65例，pT153例；初发86例，复发32例；肿瘤直径≤3cm 100例，＞3cm 18例。另取膀胱全切标本中距肿瘤边缘大于2cm的癌旁组织30例作为对照组，均经病理检查证实为正常膀胱组织。

1.2 标本制作及ALDH1表达的检测 所有标本均经10%甲醛固定，石蜡包埋常规脱水，每个石蜡切片选取最佳切取部位切片2张，厚度3μm，备染色。采用SP免疫组织化学染色方法：常规脱蜡水化，柠檬酸缓冲液热修复6min×4次，室温下复温5min，PBS洗涤5min×3次，滴加3%H2O2置于37℃温箱内培育10min，PBS洗涤5min×3次，于正常羊血清中培育20min，PBS洗涤5min×3次，滴加anti－ALDH1后置于4℃冰箱内培育过夜。第2天于室温下复温20min，PBS洗涤5min×3次，滴加聚合物辅助剂（Polymer Helper）后置于37℃温箱内培育20min，PBS洗涤5min×3次，滴加酶标记二抗（Poly－HRP anti－Goat IgG）置于37℃温箱内培育20min，PBS洗涤5min×3次，DAB显色，苏木精对比染色，脱水封片。采用已知正常肝脏组织标本切片作为阳性对照，以PBS液代替一抗作为阴性对照。

1.3 结果判断标准 阳性结果为比较鲜明的棕黄色染色，充满包浆，弥散分布。每张切片随机选取10个高倍视野，每个高倍视野计数100个癌细胞，计数阳性细胞百分数并进行评分：0分为阳性细胞百分率≤10%；1分为阳性细胞百分率为11%～40%；2分为阳性细胞百分率为41%～70%；3分为阳性细胞百分率≥70%。观察阳性细胞染色强度，根据染色强度评分：0分无染色，1分为淡黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色。结果取两者评分乘积记总分，总分＜2分为阴性，总分≥2分为阳性。

1.4 统计学分析 采用SPSS 18.0统计软件进行统计学分析。采用χ2检验分析ALDH1的表达与各种临床变量（膀胱癌组织与正常膀胱组织、性别、年龄、病理分级、病理分期、初发与复发和肿瘤大小）之间的关系；生存率分析采用Kaplan－Meier法；生存曲线比较采用Log－rank检验。

2 结 果

2.1 ALDH1在非浸润性膀胱癌及癌旁正常膀胱组织中的表达 ALDH1在膀胱癌细胞浆内出现弥漫分布棕黄色颗粒，为阳性表达；ALDH1在癌旁正常膀胱组织中为阴性表达。见图1（插页三）。ALDH1在非浸润性膀胱癌组织中阳性表达率为24.58%（29／118），在癌旁正常膀胱组织中阳性表达率为6.67%（2／30），2组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.2 ALDH1在非浸润性膀胱癌组织中表达与临床病理特征的关系 在低级别和高级别非浸润性膀胱癌组织中ALDH1阳性表达率分别为18.18%（14／77）和36.59%（15／41），二者比较差异有统计学意义（P＜0.05）；在pTa期和pT1期非浸润性膀胱癌组织中ALDH1阳性表达率分别为16.92%（11／65）和33.96%（18／53），二者比较差异有统计学意义（P＜0.05）；在初发和复发非浸润性膀胱癌中 ALDH1阳性表达率分别为19.77%（17／86）和37.50%（12／32），二者比较差异有统计学意义（P＜0.05）；在肿瘤直径≤3cm和＞3cm的非浸润性膀胱癌中ALDH1阳性表达率分别为26.00%（26／100）和16.67%（3／18），二者比较差异无统计学意义（P＞0.05）；ALDH1表达与非浸润性膀胱癌患者性别、年龄无明显关联性（P＞0.05）。见表1。

2.3 ALDH1表达与非浸润性膀胱癌患者术后4～52个月累积无瘤生存率的关系 对全组118例膀胱癌患者进行随访，从术后随访至首次发现膀胱癌复发和（或）转移，无瘤生存患者随访至52个月（52个月之前，患者由于他因死亡或中途失访，随访至死亡或失访日期，记作无瘤生存），随诊时间4～52个月。ALDH1阳性组29例，无瘤生存15例，复发13例，无转移，无瘤生存失访1例，无瘤生存率为55.17%（16／29）；ALDH1阴性组89例，无瘤生存51例，复发34例，无转移，无瘤生存失访4例，无瘤生存率为61.80%（55／89），2组患者4～52个月累积无瘤生存时间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

表1 ALDH1表达与非浸润性膀胱癌临床特征的关系Tab.1 The relationships between ALDH1expression and clinical characters of noninvasive bladder cancer

3 讨 论

肿瘤干细胞学说提出肿瘤起源于一群数量极少的干细胞，由于致癌因素导致了正常干细胞的恶变［3］，这群变异干细胞具有无限增殖和自我更新的能力，其不断增殖导致肿瘤的发生。肿瘤干细胞研究的难点在于如何对肿瘤干细胞进行分选和鉴定，常用方法是利用干、祖细胞标记物的特征进行分选。因此，肿瘤干细胞标记物成为国内外研究的新热点。乙醛脱氢酶是一种含锌酶类，其高度聚集于造血干细胞（hematopoietic stem cell，HSC）［4］，是一组可以将乙醛氧化成乙酸的细胞溶质酶，参与多种组织的分化与基因表达。ALDH1是其中一亚型，广泛分布于人体的各种组织，主要存在于肝脏等器官［5］。人类的ALDH1蛋白表达定位在细胞质中。Chute等［6］报道：ALDH1可以氧化视黄醇为视黄酸，因此在干细胞的早期分化中可能具有重要作用。

图2 ALDH1表达对非浸润性膀胱癌术后患者无瘤生存率的影响Fig.2 The effect of ALDH1expression on tumor－free survival rate in patients with nonivasive bladder cancer

2007年Ginestier等［7］发现ALDH1是乳腺癌干细胞的标记物，且与乳腺癌对抗癌药物的耐药性有关。此后，ALDH1高表达被认为是乳腺癌、头颈部鳞状细胞癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、眼癌和结直肠癌干细胞的通用标记物［8－11］。近年来，Su等［2］研究也发现：ALDH1A1表达阳性的膀胱癌细胞表现出TSC的特性，即具有与干细胞一样的自我更新和分化的潜能。常规的癌症治疗方法可能只杀死了已分化的肿瘤细胞，而保留了少量的肿瘤干细胞群，成为日后肿瘤复发的根源。所以，通过靶向治疗选择性地驱除肿瘤干细胞，对正常细胞不产生明显毒性，将是彻底根治恶性肿瘤的关键［12］。本研究检测了非浸润性膀胱癌与正常膀胱组织中ALDH1的表达，探讨了肿瘤干细胞与膀胱癌生物学特征的关系及预后的意义。

本组资料显示：ALDH1在非浸润性膀胱癌组织中的表达与患者性别、年龄及肿瘤大小无明显关联性。非浸润性膀胱癌组织中ALDH1的表达显著高于正常膀胱组织，蛋白水平检测结果表明：ALDH1的高表达与非浸润性膀胱癌的发生发展有关联性。ALDH1的表达与非浸润性膀胱癌的临床病理分期、分级呈正相关关系，ALDH1蛋白高表达可能促进了非浸润性膀胱癌的发生、发展。本研究通过对随访患者的生存时间分析显示：ALDH1表达阳性组患者与阴性组患者的无瘤生存率及无瘤生存时间有差异，提示肿瘤干细胞可能对非浸润性膀胱癌的复发有一定作用。但目前国内外尚未见相关文献报道，尚需进一步研究证实。

肿瘤干细胞标记物ALDH1的高表达与非浸润性膀胱癌的发生发展及预后密切相关。ALDH1可能成为膀胱癌病理分级、分期判断及预后评估的新指标。肿瘤干细胞可能在非浸润性膀胱癌的发生和复发中起重要作用。

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