利用转基因途径提高植物非生物胁迫耐受性的研究进展

刘春 曹丽敏 李玉中 彭晚霞 麻浩

（1.衡阳师范学院，衡阳 421008；2.中国科学院亚热带农业生态研究所，长沙 410125；3.南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室，南京 210095）

非生物胁迫贻误植物生长和生产率并且引发一系列形态学、生理学、生物化学和分子方面的变化。干旱、极端温度和盐碱化土壤是植物遇到的最常见的非生物胁迫。全球约有22%的农业土壤盐碱化［1］，干旱土壤面积已经扩大并且未来将进一步扩大。常见作物暴露在多种胁迫下，其感受和响应不同环境因子的方式可能是重叠的。干旱或盐分胁迫下大麦植株的基因表达谱表明，虽然在响应不同胁迫方面各种基因是差异化调控的，但它们可能诱导一种类似的防御反应［2］。

当植物遭遇非生物胁迫时，一系列基因被诱导，导致一些代谢物和蛋白质含量水平的增加，其中一些可能响应这些非生物胁迫从而起到某种程度的保护作用。与胁迫耐受性相关的常规育种常常从供体亲本带来不理想的农艺性状。因此，通过导入和/或过表达被选基因的基因工程植物的发展可能是促进改良植物育种的可行选择。同时，当有益基因源自有杂交障碍的物种、远亲或非植物生物时基因工程将是唯一的选择。实际上，已在转基因植株中测试了多种与抗性相关的性状，而且各种转基因技术已被用来提高植物的胁迫耐受性［3］。

如何评估转基因植株的安全性，以及如何将模式植物中的基因效应应用到作物品种中去是很重要的。但目前涉及非生物胁迫转基因植物评估的大量文献表明，试验室条件下的转基因效应不太可能在自然条件下发生。因此，这里需要一套对转基因植株响应大田环境下非生物胁迫进行严格评估的技术标准。因为迄今已投入的工作大部分仅集中在少数模式植物上。

本文总结了在干旱、盐分和低温胁迫方面利用转基因技术增强非生物胁迫耐受性的研究进展，以及如何对转基因植株进行评估。

1 单结构基因

1.1 渗透保护剂基因

严重的渗透胁迫是细胞成分有害变化的原因。迄今已在胁迫耐受性转基因植株中应用了在渗透调节期间积累的与渗透保护剂合成有关的许多基因［4］。在耐逆境生物中特殊渗透保护剂是自然积累的，但许多作物缺少合成特殊渗透保护剂的能力。如果在干旱、盐分和高温响应中渗透调节基因可以引发，那么渗透调节是植物非生物胁迫耐受性的一个好策略。因此，已经用来设计某些渗透因子或通过在植物中过表达这些渗透因子，作为耐逆境作物育种的一个潜在路线。该路线的第一步已通过编码渗透因子合成酶的基因工程获得耐逆转基因植株［5］。已有如甘氨酸-甜菜碱［6］和脯氨酸［7］等渗透保护剂应用的报道。同样，一些糖醇已作为过量产生相容性溶质的基因工程的目标，从而在胁迫期间保护细胞膜和蛋白质复合物［8］。类似的，过量表达多胺的基因工程也已发展［9］。鉴定、分离、克隆与提高洪水胁迫耐受性的相关基因的研究集中于糖酵解和乙醇发酵途径的酶类，该途径揭示在缺氧胁迫响应中呼吸链是受影响的主要途径。对烟草和水稻中丙酮酸脱羧酶（pdc）和乙醇脱氢酶（adh）基因水平的改变进行了研究，以便阐明其在水淹耐受性中的作用。过表达和低表达pdc1基因的转基因水稻也得到发展，并显示出在水淹后的生存率与高PDC的活性正相关［10］。

在上述的大部分例子中，生物合成和代谢途径的转基因修饰结果揭示了胁迫耐受性的提高和相容性溶质的积累也可能通过清除活性氧（ROS）以及在维持蛋白质结构和功能中通过其活化类分子伴侣来实现［11］。然而，观察到初级代谢的内生途径紊乱导致的多种有害效应，如细胞坏死和生长迟缓。同样，在渗透胁迫对产量潜能的负效应方面也有一些报道［12］。相容性溶质的基因操作并非总是导致化合物的显著积累，表明相容性溶质的功能不限于渗透调节，而且渗透保护剂可能并非总能提高干旱耐受性。利用鹰嘴豆的一项研究显示在干旱胁迫下渗透调节不能对产量产生有益的影响［13］。

1.2 解毒基因

在大多数好氧生物中，需要有效消除由环境胁迫而产生的ROS。根据ROS的性质，一些高毒性的需要立即解毒。为了控制ROS的水平和保护细胞免受氧化伤害，植物已进化出一套复杂的抗氧化防御系统以清除ROS。抗氧化系统包括可能在植物ROS信号中起了重要作用的各种酶类和非酶类代谢物［14］。通过解毒策略获得增强了非生物胁迫耐受性的一些转基因植物，包括过表达诸如谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）、过氧化物歧化酶（SOD）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）、谷胱甘肽还原酶（GR）等与氧化保护有关的酶类的转基因植物［15］。过表达叶绿体Cu/Zn SOD的转基因烟草［16］和马铃薯植株［17］在低温胁迫下光合性能急剧改善。过表达Mn SOD的转基因烟草植株只有在其他抗氧化酶类和底物存在时才能增强其对氧化胁迫的耐受性，表明基因型和同工酶的组成对转基因植株对非生物胁迫耐受性也有深刻的影响［18］。在叶绿体中过表达Mn SOD的转基因紫花苜蓿（Medicago sativa）植株显示能降低膜损伤［19］，转基因烟草植株过量产生紫花苜蓿醛糖还原酶基因（MsALR）显示能降低活性醛类的浓度和增强对氧化剂和干旱胁迫的耐受性［20］。

1.3 胚胎发生晚期丰富蛋白

胚胎发生晚期丰富蛋白（LEA）代表另一类高分子量蛋白质，该类蛋白质在胚胎发生晚期丰富，并在种子脱水期和对水分胁迫的响应中积累。在几组LEA蛋白中，属于第3组的被预测在隔离离子方面起作用，该组蛋白质具有11个串联重复的氨基酸模序，该模序具有重复多达13次的保守序列TAQAAKEKAGE［21］。第1组LEA蛋白被推测具有增强水分结合的能力，第5组LEA蛋白被认为在水分丧失时隔离离子。组成型过表达来自大麦的一个第3组LEA蛋白质HVA1赋予转基因水稻植株脱水和盐分胁迫耐受性［22］。尽管与先前报道的小麦栽培种、转基因水稻（TNG67）植株表达小麦LEA2蛋白（PMA80）基因或小麦LEA1蛋白（PMA1959）基因导致脱水和盐分胁迫耐受性增加的数据相比，上述报道的水分利用率（WUE）极低［23］，但在盐分和水分胁迫条件下小麦和水稻的细胞完整性方面，组成型或胁迫诱导表达HVA1基因导致胁迫耐受性的增强和生长特征的改善［24］。

1.4 转运体基因

取得非生物胁迫高耐受性的一个重要策略是帮助植物在胁迫条件下恢复离子和渗透的内稳态。这是利用基因工程提高植物盐分耐受性的一个主要途径，该途径的目标是将Na+排出根部，或贮存在液泡里。通过加强控制转运功能蛋白产生了许多非生物胁迫耐受性转基因植物。例如，在盐分胁迫条件下表达HAL1基因的转基因甜瓜［25］和番茄［26］植株，因其比对照植株保留更多的K+而表现出一定水平的盐分耐受性。

与阳离子脱毒有关的液泡氯通道基因 AtCLCd 和与酵母 NhxI 基因同源的 AtNHXI 基因已被克隆，过表达这些基因的拟南芥植株通过Na+在液泡中的区室化而增强其盐分耐受性。过表达AtNHX1 的转基因拟南芥和番茄植株通过在液泡膜中积累充足数量的转运体而表现出持续增强的盐分耐受性［27］。拟南芥中的SOS1与来自细菌和真菌质膜中的Na+/H+反转运体具有相似性，已被克隆并利用CaMV 35S启动子过表达。上调SOS1基因能提供更大的质子动力势，该动力势对于提高Na+/H+反转运体活性是必需的［28］。

1.5 脂类生物合成基因

对于转基因途径，人们也计划通过改变膜的脂类生化性质来增强非生物胁迫条件下的光合作用。活细胞对低温的适应性是通过增加脂肪酸的不饱和性导致膜脂组成改变而实现。过表达来自西葫芦（Cucurbita maxima）和拟南芥［29］的叶绿体丙三醇-3-磷酸酰基转移酶（GPAT）基因（涉及磷脂酰丙三醇脂肪酸去饱和）的基因工程烟草植株，因增加了一些不饱和脂肪酸而相应地降低了对其低温的敏感性。此外，沉默表达叶绿体ω3-脂肪酸去饱和酶（Fad7，合成三烯脂肪酸）的转基因烟草植株与野生型相比能适应高温［30］。

1.6 热激蛋白基因

热休克反应能增加响应热或其他毒剂的一套基因的转录，是一个高度保守的生物学反应，发生在所有生物体中［31］。该反应受热激转录因子（HSF）的介导，该转录因子在无胁迫细胞中以单体的、非DNA结合的形式存在，在胁迫下被激活成能结合热激基因启动子的三聚体形式。热激蛋白（Hsps）编码基因的诱导是生物体暴露在高温下时，在分子水平被观察到的一个非常突出的反应［32］。

在植物中通过增加热激蛋白的合成提高耐热性的基因工程已成功获得许多转基因植物［33］。尽管利用这些热激蛋白赋予植物胁迫耐受性的精确机理未知，但最近的研究证明，在体内能被组装成功能性胁迫颗粒（HSGs）而获得热保护功能［34］。

2 调控基因

为了修复细胞功能使植物对胁迫更有耐性，转移编码单个特异胁迫蛋白的基因可能是不够的。为了克服这些不足，利用一个基因编码一个调节许多其他基因的胁迫诱导型转录因子，从而增强面向多种胁迫的耐受性是一个有希望的途径［35］。因此，最近作物基因工程偏爱的第二类基因是那些开启调节与非生物胁迫相关的多个基因表达的转录因子基因。

2.1 转录因子

分子生物学研究表明，植物中由诸如干旱、高盐和低温等环境胁迫因子诱导的几个基因具有多种功能。大多数干旱应答基因是由植物激素脱落酸（ABA）诱导的，但也有少数基因例外。对模式植物拟南芥基因表达中的干旱应答基因的分析表明，至少存在4个独立调节系统。对典型胁迫诱导表达的一些基因中启动子的顺势作用元件和影响这些基因表达的转录子也进行了分析。分离出与脱水响应元件/C重复序列（DRE /CRT）顺势作用元件结合的转录因子，并命名为DRE 结合蛋白1/C重复序列结合因子（DREB1/ CBF）和DRE结合蛋白2（DREB2）。在转基因拟南芥植株中，DREB1/CBF 过量表达可增加其抗寒、抗旱和抗盐碱的能力。DREB1/CBF 基因成功地在许多不同作物中得到应用，从而提高作物对非生物胁迫的耐受性。对与胁迫反应相关的其他转录因子的研究也取得了进展。有关这方面的内容，已有不少综述［36-38］。

2.2 信号转导基因

植物为适应各种外界环境刺激，以最大限度地减少逆境对自身的伤害，在长期的进化过程中，从对逆境信号的感知、胞间信号转导和传递，到最终表达各种逆境基因，产生适应性，形成了一系列复杂的逆境信号传递的分子机制。虽然在细胞水平的基因调节存在多途径信号转导系统，但同一信号转导途径组分可能被干旱、盐分和寒冷等各种胁迫因子分享［39］。ABA是在信号转导途径中起作用的已知成分之一，ABA信号途径的主要负调控因子——蛋白磷酸酶2C（PP2C）是一类丝氨酸／苏氨酸蛋白磷酸酶（PSP），为ABA信号转导途径下游的关键组分。拟南芥中PP2C主要包括ABI1、ABI2、HAB1、AHG3和PP2CA，它们通过改变ABA信号的强弱等调控植物的胁迫应答［40］。促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联途径信号通路在真核生物细胞信号的转换和放大过程中起重要作用。MAPK 级联途径由3个成员组成，分别是MAPK、MAPKK 及MAPKKK，这3个信号组分按照MAPKKK-MAPKK-MAPK 的方式依次磷酸化将外源信号级联放大向下传递。大量研究表明，植物MAPK 级联途径参与调控脱落酸（ABA）信号转导［41］。Ca2+作为植物细胞中最重要的第二信使，参与植物对许多逆境信号的转导。在非生物逆境条件下，植物细胞质内的Ca2+在时间、空间及浓度上会出现特异性变化，即诱发产生钙信号。钙信号再通过其下游的钙结合蛋白进行感受和转导，进而在细胞内引起一系列的生物化学反应以适应或抵制各种逆境胁迫。目前，在植物细胞中发现Ca2+/CDPK、Ca2+/ CaM和Ca2+/CBL 3类钙信号系统，研究表明它们与非生物逆境胁迫信号转导密切相关［42］。

操纵信号因子的优点之一是它们可以控制许多的下游事件，这些事件可导致在多方面超级耐性。改变这些信号转导成分是降低细胞对胁迫环境敏感的途径。在拟南芥植株中过表达功能性保守的At-DBF2（酵母DBf2激酶同系物）表现出显著的多胁迫耐受性［43］。Pardo等［44］通过过表达钙调磷酸酶也获得了盐分胁迫耐受性转基因植株。在拟南芥中过表达一个渗透胁迫活化蛋白激酶——SRK2C，导致较高的干旱耐受性，这与胁迫响应基因的上调相一致。类似的，烟草MAPKKK、NPK1在玉米中激活了一个氧化信号级联使转基因植株具寒冷、热、盐分和干旱耐受性［45］。然而，信号因子的抑制也可有效增强植物对非生物胁迫的耐受性［46］。这个假设是基于先前的报道揭示的法昵基转移酶ERA1的a亚基和b亚基行使ABA信号负调节子的功能［47］。条件反义下调法昵基转移酶a和b亚基导致增强了拟南芥和canola油菜植株的干旱耐受性。

3 启动子的选择

转基因技术的一个重要方面是转基因的表达调控。当决定选择启动子以便增加基因的表达水平时，转基因的组织特异性表达也是一个重要的考量。因此，启动子的类型和启动子的强度对于调整植物对胁迫的响应是很关键的。一些基因的产物是大量的，如LEA3，从而需要一个很强的启动子。而有些基因产物，如多胺生物合成需要的酶，最好使用一个中等强度的诱导型启动子。迄今在产生非生物胁迫耐受性植物方面最常用的启动子包括CaMV 35S、泛素1和肌动蛋白启动子。这些启动子在自然界是组成型的，通过它们使转入的基因及其下游在所有器官和阶段大量表达。但诸如海藻糖［48］或多胺［49］等分子的组成型过量产生会导致在正常生长条件下植株的异常。且上述分子的产生也是昂贵的代谢。在这种情况下，利用胁迫诱导型启动子更合适。在植物中，各种非生物胁迫诱导许多被很好描述的有用启动子。一个理想的诱导型启动子不仅应该在缺乏诱导剂时无任何本底水平的基因表达，而且表达应是剂量依赖性的和可逆的。为了鉴定出与被非生物胁迫诱导的基因表达有关的几种顺式作用和反式作用元件，分析了干旱诱导和寒冷诱导基因的转录调控区域［50］。大部分胁迫诱导型启动子包含一个胁迫特异性顺式作用元件，该元件被必需转录因子识别。例如，hsp基因的转录调控是受定位于这些基因启动子区域5’ TATA box的核心热激元件（HSE）介导的。目前所有植物的hsp基因序列显示，在TATA基序邻近区域含有多个部分重叠的HSEs。除了这些hsp启动子，也有人在研究受渗透胁迫和缺氧胁迫诱导的rd29和adh基因启动子。拟南芥rd29A和rd29B是胁迫响应基因，脱水、高盐和低温诱导基因的rd29A启动子包括DRE 和ABRE两个元件，而rd29B启动子只包括ABREs，并且是依赖ABA诱导的。过表达来自rd29A胁迫诱导型启动子控制下的DREB1A转录因子的转基因植株，比利用获得组成型CaMV 35S启动子的植株表现出更好的表型生长［51］。Lee［52］利用来自大麦HAV22的ABRC1启动子在转基因番茄中获得一个胁迫诱导表达的拟南芥CBF1。基因表达是受DREB1A诱导的，DREB1A是受寒冷和水分胁迫诱导的，在rd29A、rd17、cor6.6、cor15A、erd10等基因的启动子中的一个顺式作用DRE元件，因此，基因产物的合成赋予植物低温和水分胁迫耐受性。玉米和水稻中呼吸链adh1基因启动子区域包含一个缺氧响应元件（ARE），缺氧响应元件（ARE）具有TGGTTT的核心元件保守序列。此外，已在如Cor 6.6、Cor 15 和 Cor 78基因中鉴定出其他的胁迫响应顺式作用启动子序列，如具有A/GCCGAC保守序列的低温响应元件（LTRD）。在胁迫诱导型启动子方面的这些发现导致基因工程化胁迫耐受性作物范式的重要转变［53］。

4 胁迫效应的生理评价

许多研究在不同的植物中评估了响应，诸如干旱、盐分和寒冷等不同胁迫的转基因效应。但用于评估胁迫响应的方法却鲜有详细信息。因此，在接下来的讨论中，我们将专注于农艺/生理视角的评估，但不意味着挑战在基因表达评估方面所做的大量工作。我们的目的是尝试协调分子和农艺两种途径朝向一个方向：育种。在转基因的胁迫响应评估方面有两个主要的议题需要强调：（1）强加的胁迫方式，有关胁迫的详细信息和生长条件；（2）支持结论的测试材料在响应方面的数据。

4.1 胁迫方式、生长环境和评价

迄今，在大部分报道中用于评估转基因材料的胁迫条件常常太严峻［54］。例如，Pellegrineschi 等［55］通过持续10 d不给盆栽的两周龄小麦苗浇水，而后复水直至成熟，比较了转DREB1A基因小麦与野生亲本的表现。未转化的植株在强加胁迫10-15 d内几乎全部死亡，但转基因植株存活下来，这样的胁迫条件在大田环境下可能不会发生。Pilon-Smits等［56］报道在水培中利用聚乙二醇（PEG）可以有效的测试植物在给定的渗透势下的某些反应，与在土壤中的环境相比，水培提供了相对不同的条件，水培溶液成分是有限且明确的。在这里，观察到的生长改良被解释为转基因植株的渗透剂的产生。因为在水培条件下水容量是无限的且水势恒定，在该系统中这种情况有发生的可能。然而，在土壤环境中，根周围土壤中供利用的水分体积是有限的，当水分被根摄取后土壤中水势会迅速下降，甚至转基因增强渗透剂产物可能不能摄取更多的水分。利用渗透势增强型转基因的一个更现实的水分摄取能力测试是比较它们从土壤系统中摄取水分的能力。Sivamani等［57］报道了在转基因小麦中WUE的增加，不幸的是报道中没有土壤蒸发的对照，而土壤蒸发是大部分水分丧失和观察到非常低的WUE的原因。此外，利用鲜重和生长率、茎的生长［52］或存活下来［44］等其他表现来间接评估很可能得出不一致的结果。因此，当实施干旱胁迫时，应对有关生长环境、植株大小、容器型号、水分供给和蒸腾作用等做详尽的描述。

4.2 应用于干旱和盐分胁迫的多种方案

在做转基因评估时，干旱胁迫的实施不是简单的截留水分。实际上，如果不了解植物在自然环境中对干旱响应的不同阶段，我们就不能洞察植物的干旱响应机理。这些阶段已在早先进行了描述［58，59］（图1）。在阶段I，水分丰富，植物可通过气孔全开放的蒸腾作用摄取全部所需水分。在此阶段，水分丧失主要决定于叶子所处的环境条件。阶段II期间，根不再能够给茎提供充足的水分，气孔逐渐关闭以调节水分供给和丧失之间的平衡，从而维持叶片的膨压。在阶段III，根已经耗尽所有可供蒸腾作用的水分。气孔关闭、包括光合作用在内的几乎所有有助于生长的生理过程均被抑制。该过程常用于设计脱水试验，在试验中植物对干旱的响应是根据可供给植物的土壤水分部分（可蒸发的土壤水分部分，FTSW），而不是实施胁迫后的天数。这样，允许在强加胁迫的试验和自然环境条件之间有一个精确的比较，这一方法在国际半干旱地区热带作物研究所（ICRISAT）成功用于评估温室环境下14个转受rd29A启动子驱动的DREB1A基因花生（图1）的响应情况［59］。

图1 花生品种JL 24对土壤干旱胁迫的一个典型响应曲线［59］

关于盐分胁迫，迄今大部分评估报道主要在苗期进行，但盐胁迫下植物在后期表现如何更值得探究。此外，评估是通过利用高浓度的盐分在短期内做出的，但这些发现甚至在高盐自然环境中显然放大了转基因工程的耐盐效应。因此，用过高浓度的盐分进行评估的方法应该避免。

我们常常假设避免Na+的积累和毒性可赋予植物盐分耐受性。因此，大部分转基因工作是处理涉及从根部排出Na+或将Na+区室化于液泡中的基因。虽然在水培条件下的严峻胁迫（超过200-300 mmol/L）［6，52］在自然环境中是不太可能发生的，但该试验中转基因植株能排泄Na+，并能维持内稳态。然而，Vadez等［60］报道在鹰嘴豆中盐分耐受性与Na+的积累差异无关。因此，在鹰嘴豆中Na+的排出策略有待进一步研究。

此外，也可根据种子产量对植物胁迫耐受性进行评估，因为生殖生长可能是受盐分影响的关键生理阶段。因此，有意增强盐分耐受性的转基因研究应该集中于对胁迫敏感的阶段。对这些过程的全面研究将有助于设计出一条更合适的转基因途径。

5 结论

本文总结了通过利用一些已克隆和描述的胁迫相关基因和转录因子来提高植物非生物胁迫耐受性的研究进展。发展非生物胁迫耐受性转基因植物的最初尝试始于单结构基因，胁迫诱导的已知功能蛋白质如水分通道蛋白、参与渗透物质生物合成的关键酶、脱毒酶类，以及转运蛋白是植物转化的最初目标。实际上，代谢性状，尤其是少数酶类作用途径的遗传特征已被阐明，并且似乎比结构和发育性状更易操纵。然而，该途径被忽视的一个事实是非生物胁迫耐受性同时与许多基因有关，单个基因的耐受性是不太可能持续发展的。因此，第二阶段的转化试图利用第三类胁迫诱导基因即调节蛋白来转化植物。通过这些蛋白质，许多与胁迫响应相关的基因可被单个基因编码的胁迫诱导型转录因子同时调节［51］，从而增强对干旱、盐分和冰冻在内的多种胁迫的耐受性。

基因工程允许对基因进行时间、组织特异性操作，以及发挥导入基因最适功能的表达水平。在产生转基因植株中最广泛应用的启动子是组成型表达，然而，当基因表达需要设计成在特异器官或特异时间表达时，这种组成型启动子可能并非合适的选择，尤其是对于胁迫诱导的基因来说。因此，最近更致力于利用胁迫诱导型启动子驱动的基因来产生转基因植株。

最后，如何对特定的非生物胁迫耐受性进行评估，尤其是自然环境条件下的非生物胁迫耐受性的评估，以及在实验室条件下获得的耐受性是否在自然条件下优于现有植物本身的耐受性，都是有待进一步解决的问题，响应非生物胁迫的不同代谢物产出的生物成本及其对产量的影响亦需进行正确的评估。

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