不同来源胶原蛋白抗冻活性的研究

阮功成，曹 慧，徐 斐，于劲松

不同来源胶原蛋白抗冻活性的研究

阮功成，曹 慧*，徐 斐，于劲松

（上海理工大学医疗器械与食品学院，上海 2000 93）

采用酶法制备不同来源的胶原蛋白，并对其纯度及氨基酸组成进行鉴定。在此基础上，利用差示扫描量热仪及低温显微镜对其热滞活性（thermal hysteresis activity，THA）和重结晶抑制效应（ice recrystallization inhibition，IRI）进行了研究。结果表明：所制备的胶原蛋白均为典型的Ⅰ型胶原，纯度较高，其分子质量约为330 kD；相比于牛血清白蛋白，不同来源的胶原蛋白中，猪皮胶原具有较高的热滞活性，即当保留温度为-0.2 ℃，体系冰晶含量φ≤5% 时，THA为0.52 ℃；在猪皮胶原蛋白体系中形成的冰晶为不规则的圆球形，不易对细胞及组织造成伤害，且经过一次循环后，冰晶无显著增大。

抗冻活性；胶原蛋白；热滞活性；重结晶抑制效应

抗冻蛋白是生物为适应极端寒冷环境而产生的一类多肽或糖肽[1-2]，能以非依数形式降低溶液的冰点，但对熔点影响甚微。抗冻蛋白最早在极地鱼类中被发现[3]。至今为止，人类已经在海洋鱼类、陆地昆虫、植物、细菌和真菌等生物体中分离得到多种抗冻蛋白[4-6]。虽然不同种类的抗冻蛋白结构各不相同，但它们都具有阻止冰晶形成、调控胞外冰晶的增长、抑制冰的重晶化，、维持液体的非依冻状态等特点。抗冻蛋白特殊的抗冻机制，使其在食品加工与保藏、冰冻手术、器官保藏及移植领域受到广泛关注。但抗冻蛋白的生产仍存在成本较高、不易产业化的特点，因而找到合适的抗冻蛋白新资源成为亟待解决的问题。

畜禽下脚料中富含胶原蛋白，胶原序列中除了-Gly-Pro（Hyp）-Y-三肽重复单元外，还有许多-Gly-Z-Y-序列[7-8]。这些重复单元与Graham等[9]从雪蚤中提取的两种抗冻蛋白（antifreeze protein，AFP）的重复序列-Gly-X-X-非常相似[10]。因而，本实验采用酶法制备了不同来源的胶原蛋白，并利用差示扫描量热法及低温显微镜法对其热滞活性（thermal hysteresis activity，THA）和重结晶抑制效应（ice recrystallization inhibition，IRI）进行了测定，以期为抗冻蛋白新资源的研究与开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

实验用鸡皮、鱼皮、猪皮购自于当地菜市场，-20 ℃保存。

胃蛋白酶（1∶10 000） 美国Sigma公司；Ⅰ型胶原标准品、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、溴酚蓝及过硫酸铵（均为电泳纯） 上海博蕴生物科技有限公司；其余试剂均为分析纯 国药集团化学试剂有限公司。

4K15型冷冻离心机 美国Sigma公司；LGJ-10型冷冻干燥机 北京四环科学仪器厂；垂直板电泳仪 美国Bio-Rad公司；PYRIS-1型差示扫描量热仪（differential scanning calorimeter，DSC） 英国Perkin Elmer公司；Olympus BH-2相差显微镜 上海普赫光电科技有限公司。

1.2 胶原蛋白的提取

根据文献[11-16]的方法从不同原料中提取胶原蛋白，具体如下：将原料剪碎（0.2 cm×0.2 cm），以10 倍体积10%丁醇溶液脱脂24 h，每12 h换一次丁醇溶液，再用蒸馏水洗净；用0.5 mol/L醋酸溶液浸泡脱脂后的猪皮12 h，并以10倍体积的0.5 mol/L醋酸溶液匀浆，在匀浆液中在加入1 g/100 mL胃蛋白酶水解48 h，离心（5 000×g，40 min），收集上清液；在上清液中加入NaCl粉末进行盐析 （使NaCl的终浓度为0.9 mol/L），静置24 h后离心（5 000×g，60 min）；收集沉淀溶于0.5 mol/L醋酸，并依次用0.02 mol/L的NaH2PO4（pH 8.6）、0.1 mol/L醋酸、蒸馏水作为透析外液进行透析，每2 h换一次透析外液；将透析袋内的样品溶液冻干，-20 ℃保存备用。

1.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）

采用SDS-PAGE电泳鉴定胶原蛋白的纯度[17]。其中分离胶8 g/100 mL，浓缩胶5 g/100 mL。将制备的胶原蛋白溶液置于沸水浴中煮沸 3 min，10 000 r/min 离心10 min，取上清液15 μL上样。120 V电压电泳完毕后，用0.1 g/100 mL考马斯亮蓝R-250溶液染色6 h，醋酸溶液脱色至背景无色后用凝胶分析仪拍照。

1.4 氨基酸分析

将制备好的胶原蛋白溶解在6 mol/L盐酸中，110 ℃水解24 h，蒸干盐酸，定容得水解液。采用Agilent1100高效液相分析仪分析水解液中氨基酸组成[18]。

1.5 胶原蛋白的热滞活性

将胶原蛋白样品配制成20 mg/mL的水溶液。称取一定质量的胶原蛋白密封于铝皿内，并置于DSC仪器内。当仪器充满液氮并稳定后，首先降温至-20 ℃保持5 min，再升温至10 ℃保持5 min，获得胶原蛋白溶液的熔融热（ΔHm）和熔点（Tm）。接着，将样品降温至-20 ℃保持5 min，然后缓慢升温至样品呈部分熔化状态，即到达其保留温度（Th），保持15 min，再将温度从Th降至-20 ℃。重复上述过程[19-20]，在不同的Th条件下停留15 min，分别记录不同Th时样品的起始结晶温度（T0）以及结晶热（ΔHr），并分别按照公式（1）和（2）计算THA和冰晶含量（φ）。以无抗冻活性的牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）作为对照。

1.6 胶原蛋白的重结晶抑制效应

采用Olympus BH-2相差显微镜和摄像装置观察胶原蛋白溶液中冰晶的生长习性和冰晶形态[21-22]。将不同来源的胶原蛋白样品稀释成质量浓度为20 mg/mL的溶液，取10 μL滴到铝板上，形成半径约为5 nm，厚度约为50 μm的小冰盘。然后将其转移到复合显微镜的冷台上，以20 ℃/min的速率降温至-40 ℃，保持5 min，再以1 ℃/min的速率升温至-14 ℃，拍照，并在-14～-12 ℃之间循环，且循环周期为3 min，并拍照。

2 结果与分析

2.1 SDS-PAGE电泳

图1 不同来源胶原蛋白的SDS-PAGE图谱Fig.1 SDS-PAGE of collagens from different sources

由图1可知，在SDS-PAGE图谱上出现了α1、α2、β及γ 4 个条带。其中，在分子质量约110 kD附近出现的2 个条带分别为胶原蛋白的α1和α2链；在220 kD附近出现的条带是α链的二聚体，即β链；在高于220 kD出现的条带是α链的三聚体，即γ链。根据已有的资料表明[23]，这是典型的Ⅰ型胶原蛋白SDS-PAGE图谱。图谱上无其他杂带，可见所 提胶原蛋白具有较高的纯度。

2.2 氨基酸分析

表1 不同来源胶原蛋白的氨基酸组成Table 1 Amino acid composition of collagens from different sources个/1 000个残基

由表1可知，不同来源胶原蛋白的氨基酸组成比较相近[11,24]。在常见氨基酸中，甘氨酸、脯氨酸和丙氨酸含量较高，其中甘氨酸含量几乎占了总氨基酸的1/3，脯氨酸和丙氨酸含量分别约为10%左右；组氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸含量较低；没有检测出半胱氨酸，缺乏色氨酸。在非常见氨基酸中，羟脯氨酸含量也较高，但在不同来源的胶原蛋白中其含量差异较大。

据研究，胶原中最主要的重复单元是（-Gly-X-Y）n和（-Gly-Z-X-）n，其中X可能是脯氨酸或羟脯氨酸，Y代表20 种氨基酸中的任何一种[24-25]。这种三肽重复序列中一些分子质量较小的氨基酸残基（如Pro、Hyp、Ser、Thr等）的羰基氧原子处于同一个肽平面，且氧原子之间的距离与排列方式与冰晶氧原子相似，因而形成的肽平面可通过氢键结合于冰晶的表面，从而抑制其生长[26]。脯氨酸和丙氨酸残基的烷基侧链可提供部分的非极性环境以稳定氢键的相互作用。Corcilius等[27]研究发现，羟脯氨酸聚合物及肽链长度对冰晶的重结晶抑制效应（ice recrystallization inhibition，IRI）有显著影响。

2.3 DSC对不同来源胶原蛋白热滞活性的测定

2.3.1 胶原蛋白样品的升降温曲线

以无抗冻活性的BSA为对照，测定了猪皮胶原蛋白的熔融点及结晶点，结果如图2所示。BSA在-1.12 ℃开始熔化，在0.94 ℃完全熔化，而胶原蛋白在-1.43 ℃开始熔化，0.46 ℃完全熔化，二者熔融峰无显著差异，都比较平缓。BSA的起始结晶温度为-14.18 ℃，降至-14.36 ℃时完全结晶，其结晶峰很窄仅为0.18 ℃，而胶原蛋白溶液在-15.42 ℃开始结晶，降温至-17.75 ℃时冻结完全，其结晶峰相对较宽为2.33 ℃。相比于BSA，胶原蛋白在降低溶液起始结晶温度的同时，也延长了其完全冻结所需要的时间。这可能是由于胶原蛋白通过氢键将其极性侧链吸附于冰晶表面，而其非极性侧链暴露在外，使冰晶形成了亚显微曲线表面，导致冰晶表面自由能增加，从而阻止其他水分子进一步与冰晶结合，降低了冰点。

图2 胶原蛋白（a）与BSA（b）的升降温曲线Fig.2 DSC curves of collagen (a) and BSA (b) during freezing and melting processes

2.3.2 BSA的热滞活性

将完全冻结的BSA升温至不同保留温度，使之处于部分熔化状态，在不同的保留温度停留一段时间，再次降温使之完全结晶。不同保留温度下BSA的热流曲线如图3所示，不同保留温度下BSA的THA如表2所示。

图3 BSA的DSC热流曲线图Fig.3 DSC curve of BSA

表2 不同保留温度下BSA的热滞活性Table 2 THA of BSA at various retention temperatures

由表2可知，随着保留温度Th的升高，部分熔融BSA平衡体系中融化量逐渐增大，冰晶含量随之逐渐减少。进一步降温，已融化部分立即重新结冰，放热峰同时出现，且随着保留温度Th的升高，再次冻结峰的面积逐步增大（图3）。变温前后的曲线平滑衔接，不存在冻结滞后的现象，也就是说BSA溶液不存在热滞效应。

2.3.3 不同来源胶原蛋白的热滞活性

将完全冻结的不同来源的胶原蛋白升温至不同保留温度，使之处于部分熔化状态，在不同的保留温度停留一段时间，再次降温使之完全结晶。不同保留温度下各胶原蛋白的热流曲线如图4～6所示，不同保留温度下各胶原蛋白的THA如表3～5所示。

图4 鸡皮胶原蛋白的的DSC热滞曲线Fig.4 DSC curve of chicken skin collagen solutio n

表3 鸡皮胶原蛋白溶液的热滞活性参数Table 3 THA parameters of chicken skin collagen

由图4、表3可见，鸡皮胶原的热滞活性较低，当保留温度为0.09 ℃时，其热滞活性最高仅为0.2 ℃。

图5 鱼皮胶原蛋白的DSC热滞曲线Fig.5 DSC curve of fish skin collagen solution

表4 鱼皮胶原蛋白溶液的热滞活性参数Table 4 THA parameters of fish skin collagen

由图5、表4可知，在鱼皮胶原体系中，随着保留温度的升高，即冰晶含量的逐渐降低，其热滞活性增加，当冰晶含量小于5%时，冻结滞后明显，其THA为0.41 ℃。

图6 猪皮胶原蛋白溶液的DSC热滞曲线Fig.6 DSC curve of pig skin collagen solution

表5 猪皮胶原蛋白溶液的热滞活性参数Table 5 THA parameters of pig skin collagen

由图6、表5可知，在猪皮胶原体系中，随着保留温度的升高，即冰晶含量的逐渐降低，热滞活性同样呈增加的趋势。当保留温度为-0.2 ℃，冰晶含量为5%时，最大的THA被获得，即为0.52 ℃。

随着冰晶含量的减少胶原蛋白的THA呈增大趋势，这可能是由于处于部分熔融状态的胶原蛋白溶液在结晶过程中，是以体系中已含有的冰晶为冰核开始结晶，体系中冰晶含量越少，冰晶表面胶原蛋白的吸附覆盖程度越高，胶原蛋白抑制冰晶继续生长的作用就越强，其溶液完全结晶所需的时间就越长，进而测得的THA也就越高。但是当初始冰晶量降到很低甚至接近于零时，体系中就不存在冰晶核，胶原蛋白不能吸附到冰晶表面而发挥作用，表现出过冷现象。由此可见，胶原蛋白的THA并不是某个恒定的值，而是在一定范围内与初始冰晶量呈负相关。胶原蛋白形成的右手螺旋可通过低分子质量氨基酸形成的肽平面向冰核棱面上堆积，并抑制其生长，因而不同来源胶原蛋白热滞活性的差异可能是其空间结构及氨基酸组成的差异导致。

2.4 低温显微镜法测定不同来源胶原蛋白的重结晶抑制效应

重结晶是指已经形成的冰晶颗粒之间重新进行分配，冰晶尺寸有的增大，有的减小，或者小冰晶聚合成大的冰晶。抗冻蛋白可以吸附到冰晶表面，抑制冰晶的迁移，从而产生重结晶抑制效应, 保护有机体免受冻结引起的伤害[2]。重结晶抑制效应可以通过低温显微镜观察法进行检测。

图7 低温显微镜观察法测定不同来源胶原蛋白的重结晶抑制效应Fig.7 Cryomicroscopic observation of ice recrystallization inhibition in collagen from different sources

BSA体系中形成的冰晶形态多为扁长形（图7Ⅰa），经过一次循环后，冰晶显著增大（图7Ⅰb）。而在各类胶原蛋白形成的体系中，冰晶多为不规则的圆球形（图7Ⅱa、7Ⅲa及7Ⅳa）。研究表明，生物避免冰冻伤害必须满足两个条件：1）冰必须在胞外形成；2）冰晶的大小及形状要受到控制。因此相比于BSA体系中形成的扁长形冰晶，胶原蛋白对冰晶的修饰作用在细胞及组织的保护中尤为重要[22-23]。经过一次循环后，猪皮胶原蛋白体系中的冰晶并没有显著生长（图7Ⅱb），表明其对重结晶有一定的抑制效应。

3 结 论

采用酶法制备了不同来源的胶原蛋白，并对其纯度、氨基酸组成及抗冻活性进行了研究。结果表明，从鱼皮、鸡皮及猪皮中提取的胶原为典型的Ⅰ型胶原，且具有较高的纯度；不同来源胶原蛋白的THA存在差异，当胶原蛋白质量浓度为20 mg/mL 时，猪皮胶原的THA为0.52 ℃，鱼皮胶原为0.41 ℃，鸡皮胶原为0.2 ℃，这可能是由于胶原空间结构及氨基酸组成的不同导致；胶原蛋白的THA并不是某个恒定的值，而是在一定范围内与初始冰晶量呈负相关；相比于BSA体系中形成的扁长形冰晶，各类胶原蛋白体系中的冰晶形态多为不规则的圆球形，经过一次循环后，猪皮胶原蛋白体系中的冰晶并没有显著生长，可见其对重结晶有一定的抑制效应。

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Antifreeze Activity of Collagens from Different Sources

NGUYEN Cong Thanh, CAO Hui*, XU Fei, YU Jin-song
(School of Medical Instruments and Food Engineering, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093, China)

In this study, collagens from different sources were prepared by means of enzymatic hydrolysis, and their purity and amino acid composition were identified. Differential scanning calorimetry (DSC) was used to determine the thermal hysteresis activity (THA), and the ice recrystallization inhibition (IRI) was evaluated by cryomicroscopy. The results showed that all the collagens prepared were typical type I collagen with high purity and molecular weight of about 330 kD. The collagens from different sources had common amino acid composition with glycine, proline and alanine as the most abundant amino acids. Compared with bovine serum albumin (BSA), the T0of pig skin collagen revealed a higher THA value (0.52 ℃), and the ice crystal content φ was equal to or less than 5% at a retention temperature Thof -0.2 ℃. As observed under a microscope, pig skin collagen extracts formed a large number of hexagonal ice crystal, demonstrating the antifreeze activity when compared with chicken skin collagen and fish skin collagen.

antifreeze activity; collagen; thermal hysteresis activity; ice recrystallization inhibition

Q51

A

1002-6630（2014）17-0022-05

10.7506/spkx1002-6630-201417005

2013-09-26

国家自然科学基金青年科学基金项目（31201421）；国家高技术研究发展计划（863计划）项目（2013AA102207）

阮功成（1981—），男，博士研究生，研究方向为食品安全检测。E-mail：congthanhcnsh@gmail.com

*通信作者：曹慧（1976—），女，副教授，博士，研究方向为功能性配料及添加剂。E-mail：caohuian@126.com