蓝莓花色苷对人脐静脉内皮细胞分泌活性氧的影响

卢新卫 冷吉燕 杜 健 李修英

(吉林大学白求恩第一医院，吉林 长春 130021)

动脉粥样硬化(AS)已成为严重危害人类健康和生命的心血管疾病之一。近年来普遍认为各种主要危险因素终将造成动脉内膜损伤，而粥样硬化斑块的形成是动脉对内膜损伤作出反应〔1〕。ROS能诱导各种类型的细胞发生损伤和凋亡，主要包括NO、O2-、H2O2、过氧亚硝酸盐阴离子(ONOO-)。在血管壁，ROS由AS斑块处巨噬细胞形成，在单核细胞、白细胞黏附后作用于内皮细胞，参与AS的发生与发展。因此，减少ROS的分泌、抑制内皮细胞的氧化损伤，可能是预防AS发生和发展的重要靶点。研究表明〔2〕，黄酮类植物化合物大多具有明显的抗氧化生物活性，保护内皮细胞主要通过以下机制：抗氧化和清除自由基，促进胆固醇逆向转运，调节血管紧张度，抑制炎症反应等。蓝莓果实富含花青素和花色苷，从其果实中提取的蓝莓花色苷同属于黄酮类化合物，本实验探讨蓝莓花色苷对内皮细胞的保护作用及其可能的机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞与主要试剂 人脐静脉血管内皮细胞株(HUVEC)(吉林大学白求恩医学院药理学实验室)、蓝莓花色苷(本课题组先期提取，并已经鉴定)、DMEM高糖培养基(美国Gibco公司)、胎牛血清(FBS)(美国Hyclone公司)、AngⅡ(美国Sigma公司)、二甲基亚砜(DMSO)(美国 Sigma 公司)、3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)(美国 Sigma 公司)、盐酸盐缓冲液(PBS)。

1.1.2主要实验器材 低温高速离心机(美国 Thermo公司)、超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)、MCO-20AIC型二氧化碳培养箱(日本SANYO公司)、CKX41型倒置显微镜(日本Olympus公司)、流式细胞仪(美国BD公司)、细胞计数板(上海求精生化试剂仪器有限公司)、细胞培养板96孔板(美国 Corning 公司)、ROS试剂盒(碧云天生物技术研究所)。

1.2方法

1.2.1HUVEC的培养、传代与鉴定 从液氮罐中取出装有HUVEC的冻存管，放入37℃水浴箱中不断摇晃，1 min内迅速解冻细胞悬液，随即于超净台内移入无菌离心管，加入2 ml DMEM高糖培养液，吹打均匀后，1 000～1 200 r/min离心3～5 min，弃上清后，再加入DMEM高糖培养液2 ml，吹打成细胞悬液，种入含10%FBS的DMEM高糖培养液的25 ml培养瓶内，置于37℃含5%CO2孵箱中培养，次日可见细胞贴壁生长，换液。3～5 d长满瓶底90%，用0.25%胰蛋白酶消化、传代，传代后隔天换液，取对数生长期细胞为实验对象。用Ⅷ因子相关抗原(SP免疫细胞化学染色法)检测阳性鉴定为内皮细胞。

1.2.2实验细胞分组及预处理 培养瓶中HUVEC生长至60%左右融合，换无血清培养液培养24 h，使细胞同步化，细胞分组处理：(1)空白对照组(Control)：HUVEC用含10%FBS+DMEM高糖培养液培养。(2)AngⅡ诱导组(AngⅡ)：HUVEC分别用10-9、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4mol/L AngⅡ+10% FBS+DMEM高糖培养液培养。(3)蓝莓花色苷组(BBA)：HUVEC分别用80、40、20、10、5、2.5 μg/ml蓝莓花色苷+10%FBS+ DMEM高糖培养液培养。(4)AngⅡ+蓝莓花色苷干预组(AngⅡ+BBA)：HUVEC在含有20 μg/ml蓝莓花色苷的培养液中孵育2 h后，再加入10-6mol/L AngⅡ，共同孵育24 h。上述各组细胞均置于5%CO2、37℃、饱和湿度培养箱中培养。

1.2.3MTT法检测HUVEC活性 取对数生长期HUVEC一瓶，超净台内用PBS洗涤2次，用0.25%胰蛋白酶消化获得细胞后计数，设定每孔接种细胞数为5×103个，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液配成单细胞悬液；无菌条件下将细胞悬液按200 μl/孔接种于96孔培养板内。5%CO2、37℃、饱和湿度培养箱中培养24 h，待细胞贴壁后，吸去培养液；根据上述不同的实验设计分组加药，设不加细胞不加药组为调零孔；培养一定时间后，每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl，37℃继续培养3～4 h后，可见有紫蓝色的甲臜结晶形成，小心吸取孔内上清液，弃去后每孔加入150 μl DMSO溶液，摇床上充分振荡10 min，溶解结晶；选择490 nm波长，在酶标仪上测定各孔吸光值(OD)值，并记录结果。以上实验至少重复3次。

1.2.4ROS的测定 取对数生长期的细胞，消化后以7×104/ml细胞悬液接种于96孔板中，次日给药，每组设6个复孔。给药24 h后，吸取各孔内上清液并弃去，用PBS洗2遍后，每孔中加入100 μl PBS，按照-80℃ 5 min，室温下融化，反复冻融3次，收集50 μl上清液备用。按照ROS测定试剂盒说明书严格操作，测定胞内ROS水平。

1.3统计学分析 采用SPSS13.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1AngⅡ对HUVEC增殖活性的影响 给药24 h后各浓度AngⅡ对HUVEC的增殖都有抑制作用，有一定的浓度依赖性，浓度≥10-6mol/L时对HUVEC的增殖抑制作用更加显著。与空白对照组比较，AngⅡ浓度为10-6mol/L时细胞增殖被抑制了27%(P<0.01)；给药48 h后，AngⅡ诱导组各浓度对HUVEC的增殖都有抑制作用，有明显的剂量依赖，与空白对照组比较，AngⅡ浓度为10-6mol/L时细胞的增殖被抑制了32%(P<0.01)。选取10-6mol/L作为AngⅡ最适实验浓度。

2.2蓝莓花色苷对HUVEC增殖活性的影响 给药24 h后，低浓度蓝莓花色苷可轻度增加 HUVEC的活性；呈浓度依赖性，当浓度≥40 μg/ml时出现抑制作用，也有一定的浓度依赖性；与空白对照组比较，最高浓度使细胞增殖抑制了11%(P<0.01)；给药48 h后，蓝莓花色苷浓度≥40 μg/ml时对HUVEC的增殖亦有抑制作用，与空白对照组比较，最高浓度时细胞的增殖被抑制了16%(P<0.01)。本实验选取20 μg/ml作为蓝莓花色苷的最适实验浓度。

2.3蓝莓花色苷对HUVEC内ROS的影响 蓝莓花色苷干预组HUVEC胞内ROS的水平下降，抑制了胞内ROS的产生。

3 讨 论

内皮细胞位于血管壁的最内层，不仅是血管的保护屏障，更是人体内最大的内分泌器官，其合成与释放的舒血管活性物质与缩血管活性物质对维持正常的血管功能尤其是血管舒缩状态至关重要。内皮细胞通过分泌ROS、NO、PGI2以及ET、AngⅡ等血管活性肽调节血管张力〔3〕。内皮依赖性收缩和舒张因子的失衡可导致内皮细胞功能损伤和障碍，多种疾病如高血压病、糖尿病、代谢综合征、肿瘤以及炎症等与内皮功能障碍具有密切关系〔4〕。缩血管因子AngⅡ是肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)的重要组成部分，AngⅡ通过血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1R)诱导凝集素样氧化低密度脂蛋白受体-1(LOX-1)的表达，而LOX-1的激活能上调AT1R的表达，ACEI则能抑制NADPH氧化酶的活化，减少ROS的生成〔5，6〕。研究表明，氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的LOX-1表达与ROS-NF-κB信号途径激活存在正反馈效应〔7〕。

蓝莓花色苷是从蓝莓果实中提取的一种黄酮类化合物，具有抗氧化、清除自由基〔8〕，降低血脂等作用，对心血管系统有保护作用〔9，10〕。随着细胞培养和免疫组化技术的发展，黄酮类植物化合物在多种代谢性疾病，如动脉粥样硬化、高血压、糖尿病等的作用机制研究也将越来越深入。

4 参考文献

1陈灏珠.循环系统疾病内科学〔M〕.第7版.北京：人民卫生出版，2008:268.

2Linsel-Nitschke P, Tall AR. HDL as a target in the treatment of atherosclerotic cardiovascular disease〔J〕. Nat Rev Drug Discov,2005;4(3):193-205.

3Feletou M, Kohler R, Vanhoutte PM. Endothelium-derived vasoactive factors and hypertension: possible roles in pathogenesis and as treatment targets 〔J〕. Curr Hypertens Rep,2010;12(4):267-75.

4Higashi Y, Sasaki S, Nakagawa K,etal.Endothelial function and oxidative stress in renovascular hypertension〔J〕. N Engl J Med,2002;346(25):1954-62.

5Ghiadoni L, Magagna A, Versari D,etal. Different effect of antihypertensive drugs on conduit artery endothelial function〔J〕.Hypertension,2003;41(6):1281-6.

6Yoshida J, Yamamoto K, Mano T,etal. AT1 receptor blocker added to ACE inhibitor provides benefits at advanced stage of hypertensive diastolic heart failure〔J〕. Hypertension,2004;43(3):686-91.

7Sun Y, Chen X. Ox-LDL-induced LOX-1 expression in vascular smooth muscle cells: role of reactive oxygen species 〔J〕. Fund Clin Pharmacol,2011;25(5):572-9.

8Seeram NP, Momin RA, Nair MG,etal. Cyclooxygenase inhibitory andantioxidant cyanidin glycosides in cherries and berries〔J〕. Phytomedicine,2001;8(5):362-9.

9Abidov M, Jimenez Del Rio M, Ramazanov A,etal. Efficiency of pharmacologically-active antioxidant phytomedicine Radical Fruits in treatment hypercholesteremia at men〔J〕. Georgian MedNews,2006;140:78-83.

10de Pascual-Teresa S, Moreno DA, García-Viguera C. Flavanols and anthocyanin in cardiovascular health: a review of current evidence〔J〕. Int J Mol Sci,2010;11(4):1679-703.