缬沙坦减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤的研究

朱银川，康丹丹，汤建民，王琼

缬沙坦减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤的研究

朱银川，康丹丹，汤建民，王琼

目的：探讨缬沙坦对大鼠心肌缺血再灌注损伤保护的可能机制。

方法：将30只大鼠分为假手术组，缺血再灌注组，缬沙坦预处理组，每组10只。缬沙坦预处理组给予缬沙坦（30 mg/kg），1次/天，灌胃治疗4周，其余二组给予等体积的生理盐水。建立心肌缺血再灌注损伤模型成功后，取血样检测血清超氧化物歧化物（SOD）活性和丙二醛含量；取相应的左心室区域，应用蛋白印迹法、逆转录聚合酶链反应法测定各组心肌组织中一氧化氮合酶（iNOS）、解偶联蛋白2信使核糖核酸（UCP2 mRNA）和蛋白的表达。

结果：SOD活性：缺血再灌注组、缬沙坦预处理组比假手术组均减少（P＜0.01），缬沙坦预处理组高于缺血再灌注组（P＜0.01）。丙二醛含量：缺血再灌注组、缬沙坦预处理组比假手术组均升高（P＜0.01），缬沙坦预处理组低于缺血再灌注组（P＜0.01）。iNOS和UCP2 mRNA的相对表达量：缺血再灌注组、缬沙坦预处理组比假手术组均升高（P＜0.01），缬沙坦预处理组高于缺血再灌注组（P＜0.01）。iNOS和UCP2蛋白的表达量：缺血再灌注组、缬沙坦预处理组比假手术组均升高（P＜0.01），缬沙坦预处理组高于缺血再灌注组（P＜0.01）。

结论：缬沙坦可通过提高iNOS、UCP2的表达,减少和清除氧自由基起到保护心肌缺血再灌注损伤的作用。关键词 心肌缺血再灌注损伤；诱导型一氧化氮合酶；解偶联蛋白2；缬沙坦

(Chinese Circulation Journal, 2014,29:382.)

随着心肌梗死的溶栓治疗、经皮冠状动脉腔内成形术等血运重建治疗术在临床实践中的不断普及，所面临心肌缺血-再灌注损伤的问题也日益受到重视，若能防治心肌缺血再灌注损伤，缺血心肌将能从再灌注疗法中获得更佳疗效。缺血再灌注损伤的发生机制尚未完全阐明，目前认为引起再灌注损伤的主要机制与自由基损伤作用、细胞钙超载、白细胞与微血管功能障碍等有关[1]，其中自由基与各种细胞结构成分如膜磷脂、蛋白质、核酸等发生反应是造成心肌缺血-再灌注损伤的主要原因。近年来国外研究提示诱导型一氧化氮合酶（iNOS）在自由基的代谢过程中起到重要作用，解偶联蛋白是线粒体内膜上的质子转运蛋白，能够在线粒体自由基增多时转运质子进入线粒体内膜，从而减少自由基的产生。血管紧张素转换酶抑制剂氯沙坦能够减少心肌梗死面积、室性心律失常，但具体机制仍不清楚[2]。本研究通过建立大鼠缺血再灌注损伤模型，检测心肌解偶联蛋白2（UCP2）及诱导型iNOS的表达，探索缬沙坦预处理对心肌的保护机制，为药物治疗提供线索及依据。

1 材料与方法

2013-03由河南省动物实验中心提供健康成年雄性SD大鼠30只，体重200～250 g，采用随机数字法分为假手术组，缺血再灌注组，缬沙坦预处理组，每组10只。缬沙坦预处理组给予缬沙坦30 mg/（kg·d） 灌胃（缬沙坦片 80 mg/片，国药准字J20070026，进口药品注册证号BH20060395），1次/天，灌胃治疗4周，其余二组给予等体积的生理盐水灌胃。灌胃4周后制作大鼠缺血再灌注模型，用3%戊巴比妥钠 50 mg/kg腹腔注射。麻醉成功后，将大鼠置于手术台上，头部及四肢固定于木板上，心电图连接于四肢皮下，记录心电图变化。气管切开插管，呼吸机辅助呼吸（Hx-100E小动物呼吸机购自成都）。分离大鼠胸骨左缘3～5肋间。扩胸器扩胸，暴露心脏，提取并剪开心包，轻轻挤出心脏上翻，于左心耳根部冠脉动脉起始处，用6/0丝线穿过该动脉。假手术组只穿线不结扎，余两组用一带有凹槽的细乳胶管，垫于血管与结扎线之间，结扎30 min，结扎线远端的缺血心肌变白，颜色变暗，心电图显示ST呈弓背向上抬高提示结扎成功。剪开结扎线，取出细乳胶管，再灌注后缺血部位心肌颜色恢复，ST段回落，证实结扎血管再灌注成功。关胸后再灌注120 min。经颈动脉取血样2 ml，检测超氧化物歧化物（SOD）的活性，及丙二醛含量。实验结束后摘取心脏，获取左心室缺血区心肌组织，分为两份，用预冷的磷酸盐水洗净残血，一份在液氮中迅速冷冻，另外一份存放于-80℃冰箱保存备用。

各组血清丙二醛含量和SOD活性的测定：于关胸后再灌注120 min时，经颈动脉取血样2 ml，4000 r/min离心15 min，取上清，按试剂盒说明采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD的活性，硫代巴比妥酸法测丙二醛含量。试剂盒购自北京博大泰克公司。

心肌组织iNOS和UCP2 信使核糖核酸（mRNA）表达的检测：所取的心肌组织，加入一种总RNA抽提试剂Trizol液1m l中研磨吹打成匀浆后提取心肌细胞核糖核酸（RNA），逆转录为互补RNA（cRNA）（逆转录试剂盒为Transgene公司产品）。采用逆转录聚合酶链反应法进行扩增。甘油醛-3-磷酸脱氢酶上游引物序列为为5'CCACGGCAAGTTCAACGGCACA 3'，下游引物序列为 5' GCGGCATGTCAGATCCACAACG 3'。UCP2上游引物：5' TCCTGGCAGGTAGCACCA 3'，下游引物：5' CCCGAAGGCAGAAGTGAAG 3'。iNOS上游引物序列为5' GCTGTCTGACCCTCATTTT 3'，下游引物序列为5' GCTGTCTGACCCTCATTTT 3'。扩增条件如下：94℃预变性2 m in，1个循环；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，共35个循环；72℃总延伸6 min。取5 μl扩增产物与缓冲液混合后经2%琼脂糖凝胶，溴化乙锭染色，在紫外线投射下观察电泳电泳条带，用D-140图像记录分析系统进行分析，目的基因UCP2、iNOS mRNA 的表达量以 UCP2、iNOS的脱氧核糖核酸(DNA)条带和甘油醛-3-磷酸脱氢酶的DNA条带灰度值比值计算。小鼠抗大鼠UCP2抗体、羊抗大鼠iNOS抗体、甘油醛-3-磷酸脱氢酶抗体均由美国Santa cruz公司提供，二抗由美国Zymed公司提供，iNOS、UCP2和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（内参）引物均购自北京博大泰克公司。

心肌组织iNOS和UCP2蛋白表达的蛋白印迹法检测：提取好的组织用组织细胞裂解液对组织进行裂解。裂解液按等蛋白量上样进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并电转移到聚偏二氟乙烯膜上，经封闭、洗膜后，加入一抗4℃孵育过夜，再加入二抗37℃孵育45 min，漂洗后室温超敏发光化学试剂显色，蒸馏水洗涤。观察并照相，进行图像分析。

统计学处理：采用SPSS 17.0进行统计学分析。三组间丙二醛的含量,SOD活性，iNOS、UCP2蛋白和mRNA表达的比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。各检验水准α=0.05，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

SOD活性：缺血再灌注组、缬沙坦预处理组比假手术组均减少（P＜0.01），缬沙坦预处理组高于缺血再灌注组（P＜0.01）。丙二醛含量：缺血再灌注组、缬沙坦预处理组比假手术组均升高（P＜0.01），缬沙坦预处理组低于缺血再灌注组（P＜0.01）。iNOS和UCP2 mRNA的相对表达量：缺血再灌注组、缬沙坦预处理组比假手术组均升高（P＜0.01），缬沙坦预处理组高于缺血再灌注组（P＜0.01）。iNOS和UCP2蛋白的表达量：缺血再灌注组、缬沙坦预处理组比假手术组均升高（P＜0.01），缬沙坦预处理组高于缺血再灌注组（P＜0.01）。表 1，图 1、2、3

表1 3组各项指标结果比较（ ±s）

表1 3组各项指标结果比较（ ±s）

注：与假手术组相比*P＜0.01；与缺血再灌注组相比△P＜0.01。SOD：超氧化物歧化物 iNOS：一氧化氮合酶 UCP2：解偶联蛋白2 m RNA：信使核糖核酸

假手术组 (n=10) 缺血再灌注组 (n=10) 缬沙坦预处理组 (n=10)SOD 活性 (U/m l) 176.175±9.068 119.188±10.830* 132.562±8.468*△丙二醛含量 (nm o l/m l) 1.483±0.159 2.676±0.280* 2.148±0.194*△逆转录多聚酶链反应结果iNOS m RNA 相对表达量 0.327±0.030 0.529±0.060* 0.938±0.128*△UCP2 m RNA 相对表达量 0.177±0.034 0.470±0.051* 0.670±0.125*△蛋白印迹法结果iNOS 蛋白表达量 0.169±0.016 0.333±0.069* 0.578±0.062*△UCP2 蛋白表达量 0.115±0.023 0.277±0.028* 0.411±0.063*△

图1 各组大鼠心肌组织解偶联蛋白2逆转录聚合酶链反应结果

图3 各组大鼠心肌组织解偶联蛋白2和一氧化氮合酶的蛋白印迹法结果

图2 各组大鼠心肌组织一氧化氮合酶逆转录聚合酶链反应结果

3 讨论

血清丙二醛是氧自由基（尤其是超氧阴离子）作用于膜不饱和脂肪酸的产物，丙二醛不仅反映脂质过氧化程度，也可间接反映氧自由基的生成量，可以判断心肌缺血再灌注损伤的程度[3]。SOD能有效地清除氧自由基，使机体免于自由基的损伤。当机体产生的氧自由基过多或清除自由基的能力不足时，过多的氧自由基将引起细胞膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化，从而导致细胞膜的结构和功能的损害，因此，SOD活性的变化可影响到组织中的氧自由基浓度，可间接反映心肌抗氧化损伤的能力[4]。本实验观察到缺血再灌注组的丙二醛含量增加和SOD活性下降，表明缺血再灌注后氧自由基产生有显著的增加，而给予缬沙坦干预后，丙二醛的含量降低，SOD活性增加，表明缬沙坦可以使大鼠心肌抗氧化酶的活性增加，清除氧自由基，起到保护缺血-再灌注心肌的作用。

心肌在正常情况下不合成一氧化氮，只有在缺血、缺氧和某些细胞因子如肿瘤坏死因子等的激活下可诱导心肌组织诱导型iNOS的表达，催化底物L-精氨酸产生释放大量一氧化氮[5]。一氧化氮可作用于血管平滑肌产生扩血管作用，抑制炎症反应[6]，抑制血管内皮细胞增殖、清除自由基，减轻钙超载。iNOS/一氧化氮在心肌缺血再灌注损伤中有双重作用。研究证实在缺血再灌注过程中下调iNOS的表达具有保护作用[7]。但也有研究发现缺血预处理的保护作用与心肌组织中的iNOS表达上调有关，而且敲除iNOS基因可以消除这种保护作用[8]。iNOS/一氧化氮所起的双重作用可能与iNOS所催化产生的一氧化氮的数量、一氧化氮所释放的环境有关，同时也受到所研究模型的影响[9]。研究证明坎地沙坦可上调iNOS的表达，促进一氧化氮的释放达到保护血管内皮，改善血管重塑的作用[10]。杨丽云等[11]研究证明坎地沙坦能够改善自发性高血压大鼠的主动脉舒缩功能及结构，并上调iNOS的表达。本实验结果显示：与假手术组比较，缺血再灌注组和缬沙坦预处理组iNOS蛋白和mRNA表达量升高（P＜0.01）；缬沙坦预处理组iNOS蛋白和mRNA表达量高于缺血再灌注组（P＜0.01），表明缬沙坦预处理可能通过提高iNOS的表达，促进一氧化氮的释放，清除氧自由基而起到心肌保护的作用。

UCP2是线粒体内膜蛋白质，可引起质子漏，降低质子跨膜梯度，使活性氧产生减少，减少自由基的生成。有研究发现,UCP2过表达可降低大鼠心肌细胞活性氧水平及细胞内Ca2+浓度[12]，而心肌缺血-再灌注后, UCP2表达增加, 伴随受损心肌细胞的减少[13]，提示UCP2表达增加可起到保护细胞的作用。研究表明血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂可以调节UCP2在大鼠肝脏和肾脏中的表达[14，15]，促进线粒体UCP2表达增高[16]。本实验结果示：与假手术组比较，缺血再灌注组和缬沙坦预处理组UCP2蛋白和mRNA表达量升高（P＜0.01）；缬沙坦预处理组UCP2蛋白和mRNA表达量高于缺血再灌注组（P＜0.01），表明缬沙坦可能通过提高UCP2的表达，减少活性氧的生成，从而通过减少氧自由基的生成起到心肌保护的作用。

综上所述，本实验结果证明缬沙坦可清除氧自由基起到保护缺血再灌注心肌的作用，这可能与提高iNOS的表达增加一氧化氮的释放，提高UCP2的表达，减少活性氧的释放有关。至于UCP2和iNOS/一氧化氮系统间有怎样的联系，需进一步研究探讨。

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（编辑：王宝茹）

Valsartan Decreasing the Myocardial Ischem ia Reper fusion Injury in Exprimental Rats

ZHU Yin-chun, KANG Dan-dan, TANG Jian-m in, WANG Qiong.
Department of Cardiology, The Second A ffi liated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou (450014), Henan, China

TANG Jian-m in, E-mail: tjmgrx@yahoo.com

Objective: To explore the possible protective mechanism of valsartan on myocardial ischem ia reperfusion (I/R)injury in experimental rats.

Methods: The I/R model was established by 30 m in of left anterior descending artery (LAD) occlusion w ith the subsequent reperfusion for 120 min. A total of 30 male SD rats were divided into 3 groups, n=10 in each group. Sham operation(SH) group, IR group and Valsartan pre-treatment (Valsartan) group, in which the rats received valsartan 30 mg/(kg⋅day), and the other 2 groups received the same amount of normal saline. All animals were treated for 4 weeks. The serum levels of super oxide dismutase (SOD) and maleic dialdehyde (MDA) were examined. Real-time RT-PCR was conducted to quantitatively calculate the mRNA expressions of uncoupling protein-2 (UCP2) and induced nitric oxide synthase (iNOS), Western blot analysis was used to detect the protein expressions of UCP2 and (iNOS) in myocardial tissue.

Results: ① Compared w ith SH group, the serum SOD levels decreased in IR group and Valsartan group, while it was higher in Valsartan group; the MDA levels increased in IR group and Valsartan group, while it was lower in Valsartan group, all P＜0.01. ② The mRNA expressions of UCP2 and iNOS increased in IR group and Valsartan group and it was even higher in Valsartan group, all P＜0.01. ③ The protein expressions of UCP2 and iNOS elevated in IR group and Valsartan group and it was even higher in Valsartan group, all P＜0.01.

Conclusion: Valsartan could increase UCP2, iNOS expression, decrease the serum levels of SOD, MDA and therefore, protect myocardial I/R injury in experimental rats.

Myocardial ischem ia reperfusion injury; Induced nitric oxide synthase; Uncoupling protein-2; Valsartan

450014 河南省郑州市，郑州大学第二附属医院 心血管内科（朱银川、康丹丹、汤建民）,干部病房（王琼）

朱银川 硕士研究生 主要从事冠心病及相关疾病的研究 Email：512311627@qq.com 通讯作者：汤建民 Email：tjmgrx@yahoo.com

R542.2

A

1000-3614（2014）05-0382-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2014.05.016

2013-10-30）

病例报告