金莲花口服液HPLC指纹图谱及有效成分含量测定

任桂玲，郭艳玲，董晓强，李沈明△

(1.承德医学院，河北承德 067000;2.颈复康药业集团有限公司)

金莲花口服液HPLC指纹图谱及有效成分含量测定

任桂玲1、2，郭艳玲2，董晓强2，李沈明2△

(1.承德医学院，河北承德 067000;2.颈复康药业集团有限公司)

目的:建立金莲花口服液有效的质量评价方法。方法:通过建立HPLC指纹图谱和检测金莲花口服液中有效成分荭草苷、牡荆素的含量，对市售金莲花口服液的质量进行分析。采用Phenomenex C18(4.6×250mm,5μ m)色谱柱;乙腈-0.1%磷酸-0.1%四氢呋喃溶剂系统梯度洗脱;检测波长230nm;流速1.0ml/min。结果:确定了20个共有峰，市售金莲花口服液指纹图谱峰相似度均＞0.94;荭草苷的线性范围:10.00-392.80μ g/ml(r=0.9999)，牡荆苷的线性范围:2.40-94.90 μ g/ml(r=0.9999);荭草苷平均回收率为101.85%，RSD为1.61%(n=6)，牡荆苷平均回收率为102.53%，RSD为1.45%(n=6)。结论:本研究建立的金莲花口服液指纹图谱，以及荭草苷和牡荆素含量测定方法简便、准确、灵敏度高，稳定性和重现性良好，可为金莲花口服液的质量控制提供依据。

金莲花口服液;质量控制;指纹图谱;荭草苷;牡荆素

金莲花口服液是由金莲花单味药材组成的制剂，用于风热邪毒袭肺，热毒内盛引起的上呼吸道感染、咽炎、扁桃体炎[1]。研究表明，其抗菌主要有效成分是黄酮类化合物，含有荭草苷、牡荆苷、槲皮素等成分[2-3]。金莲花口服液的现行质量标准为高效液相色谱法检测荭草苷的含量，难以有效综合地评价金莲花口服液的内在质量[1]。本研究采用HPLC法建立了金莲花口服液的指纹图谱，对市售金莲花口服液进行相似度评价，同时对荭草苷、牡荆素两个有效成分进行含量测定，以期为金莲花口服液的质量控制提供科学依据。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1200高效液相色谱仪，DAD检测器，安捷伦科技有限公司;AE 240十万分之一电子分析天平，瑞士梅特勒;KQ-500DE型数控超声仪，昆山市超声仪器有限公司。

1.2 试药 金莲花口服液，颈复康药业(A厂)12批、吉林敖东延边药业(B厂)1批、武汉第六制药(C厂)1批、牙克石森健药业(D厂)1批、石家庄四药(E厂)1批，批号分别为:293013、393012、293003、293002、293014、293011、293001、293004、293012、293014、293023、393013、1209001、20130701、20130102、130401。荭草苷对照品，中国药品生物制品检定所，批号:111777-200801;牡荆苷对照品，中国药品生物制品检定所，批号:111687-200602。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 采用Phenomenex C18色谱柱(4.6×250mm，5μm);A(乙腈)-B(含0.1%磷酸及1%四氢呋喃的溶液)为流动相，进行梯度洗脱，0-20min-38min-55min-70min，A相为3%-16%-16%-30%-50%，流速:1.0ml/min，柱温25℃，检测波长230nm，进样量10μl，记录70min。结果显示，荭草苷峰和牡荆素峰与其相邻峰的分离度均＞1.5。

2.2 供试品溶液的制备 精密量取金莲花口服液1ml，置25ml容量瓶中，加入适量80%甲醇，超声10min，取出，放冷，80%甲醇定容，过滤，精密量取续滤液5ml置10ml容量瓶中，80%甲醇定容至刻度，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液即得。

2.3 对照品溶液的制备 精密称取荭草苷和牡荆苷对照品适量，加甲醇溶解制成含荭草苷(0.3928mg/ml)和牡荆苷(0.0949mg/ml)的混合对照品储备液，备用。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察:混合对照品储备液作为1号溶液，采用倍比稀释法制成系列浓度溶液，得2-5号混合对照品溶液，荭草苷浓度分别为0.1571、0.0628、0.0251、0.0100mg/ml，牡荆苷浓度分别为0.0380、0.0152、0.0061、0.0024mg/ml，以色谱峰面积为纵坐标(Y)、对照品浓度为横坐标(X)进行线性回归。回归方程:荭草苷:Y=18253X-19.422(r=0.9999)，牡荆苷:Y=19350X+ 4.6767(r=0.9999)。结果显示荭草苷在0.0100-0.3928mg/ ml、牡荆苷在0.0024-0.0949mg/ml呈良好线性关系。

2.4.2 精密度试验:取同一份供试品溶液连续进样5次，记录指纹图谱，20个共有峰的相对保留时间RSD＜1.96%、相对峰面积RSD＜2.68%，表明仪器精密度良好。

2.4.3 重复性试验:取同一批号的样品5份，记录指纹图谱，20个共有峰的相对保留时间RSD＜1.94%、相对峰面积RSD＜2.82%，同时计算荭草苷和牡荆素的含量，平均含量分别为2.28mg/ml和0.57mg/ml，RSD分别为1.93%和1.58%，结果显示重复性良好。

2.4.4 稳定性试验:取同一份供试品溶液，分别在0、2、4、8、10h进行指纹图谱测定，20个共有峰的相对保留时间RSD＜1.96%、相对峰面积RSD＜2.68%，表明供试品溶液在10h内稳定。

2.4.5 加样回收率试验:精密量取已知荭草苷和牡荆苷含量的同一批号样品，分别加入2种对照品适量，以样品溶液中绝对含量计算加样回收率，结果见表1:荭草苷平均回收率为101.85%、RSD为1.61%，牡荆苷平均回收率为102.53%、RSD为1.45%。

表1 荭草苷和牡荆素加样回收率试验结果

2.5 样品含量测定 取1.2中市售不同厂家的金莲花口服液，每份样品检测3次，计算荭草苷和牡荆素的总量，结果见表2:市售金莲花口服液的质量存在一定差异(总量=荭草苷均值+牡荆素均值)。

表2 不同厂家金莲花口服液中荭草苷和牡荆素含量测定结果

2.6 指纹图谱 采用国家药典委员会推荐的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》进行数据分析处理，以中位数法生成对照图谱，建立金莲花口服液指纹图谱色谱叠加图，并进行相似度评价。结果显示，A厂12批次市售产品指纹图谱相似度为0.971-0.988(表3);5个厂家市售产品的指纹图谱与其所生成的对照指纹图谱(附图)比较，相似度为0.948-0.984(表4)。可见，市售金莲花口服液指纹图谱差异性不大。

附图 5个厂家金莲花口服液的指纹图谱

表3 A厂金莲花口服液的相似度

表4 5个厂家金莲花口服液的相似度

3 讨论

3.1 指纹图谱分析 本研究显示，各厂家产品指纹图谱与共有模式相似度较高，但各峰相对比例大小有差别，并且有个别色谱峰数目不同，说明市售金莲花口服液化学成分基本一致，但各厂家选取药材的质量、成分有差异性。

3.2 共有峰和参照峰 选择稳定性好、吸收峰强、特征明显的色谱峰为共有峰，选择峰面积较大、出峰时间适中且稳定的7号荭草苷峰作为参照峰。

3.3 检测波长的确定 参照文献[4-8]中检测波长进行实验，结果均不太理想。对供试品溶液及对照品溶液在190-400nm进行全波段扫描，选择色谱峰数目较多、基线平稳，能对荭草苷和牡荆素进行定量分析、能避开溶剂吸收的波段，检测波长确定为230nm。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典.第二增补本[S].北京:化学工业出版社，2013.48-49.

[2]魏金霞，李丹毅，华会明，等.金莲花化学成分的分离与鉴定(Ⅱ)[J].沈阳药科大学学报，2012，29(1):12-15.

[3]袁勤洋，刘长利.中药金莲花药理作用研究进展[J].人民军医，2011，54(9):825-826.

[4]张水利，苏连杰.金莲花茎叶的HPLC指纹图谱研究[J].中草药，2012，43(6):1199-1202.

[5]马英丽，胡冰，田振坤，等.金莲花药材HPLC指纹图谱研究[J].中草药，2006，37(12):1873-1875.

[6]王巧，许磊，冯超，等.金莲花药材高效液相色谱法指纹图谱分析[J].时珍国医国药，2010，21(2):331-332.

[7]李艳荣，杜义龙，潘海峰.金莲花药材高效液相色谱指纹图谱及两种黄酮类成分含量测定[J].医药导报，2012，31(11):1500-1505.

[8]谭安菊，周雯，陈慧，等.金莲花药材高效液相色谱指纹图谱研究[J].贵阳医学院学报，2013，38(5):489-492.

STUDY ON FINGERPRINT AND DETERMINATION OF ACTIVE INGREDIENTS IN TROLLII FLOS ORAL LIQUID BY HPLC

REN Gui-ling, GUO Yan-ling, DONG Xiao-qiang, et al
(Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective:To establish effective quality evaluation methods of Trollii Flos Oral Liquid (TFOL).Methods:The quality of commercially available TFOL was analyzed by establishing fi ngerprint by HPLC and determining the content of active ingredients, orientin and vitexin. Phenomenex C18column (4.6×250mm, 5μm) was used with mobile phase was acetonitrile-0.1% phosphoric acid-0.1% tetrahydrofuran, determine wavelength was 230nm, fl ow velocity was 1.0ml/min.Results:This study determined 20 common peaks, and the similarity fi ngerprint peaks of commercially available TFOL were all greater than 0.94. The linear range of orientin and vitexin were 10.00-392.80(r = 0.9999) and 2.40-94.90 μg/ml (r = 0.9999); the average recovery rate were 101.85% and 102.53%; the RSD were 1.61% (n=6) and 1.45% (n=6).Conclusions:The method in this study that establishing TFOL fi nger print and determination of orientin and vitexin is simple, accurate, high sensitive, and also with better stability and reproducibility. So this method can provide basis for quality control of TFOL.

Trollii Flos Oral Liquid (TFOL); Quality control; Fingerprint; Orientin; Vitexin

R286

A

1004-6879(2014)06-0463-03

△ 通讯作者

2014-05-15)