阿基瑞林合成条件的优化

赵红玲，高 杨，王小青，王良友，尹志峰

(承德医学院中药研究所，河北省中药研究与开发重点实验室，河北承德 067000)

技术方法

阿基瑞林合成条件的优化

赵红玲，高 杨，王小青，王良友，尹志峰

(承德医学院中药研究所，河北省中药研究与开发重点实验室，河北承德 067000)

阿基瑞林;固相合成;条件优化

阿基瑞林(Argireline，Ac-Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg-NH2)，又名乙酰六胜肽-3，又被称为类肉毒杆菌素，是模仿SNAP-25蛋白N端6个氨基酸的寡肽[1-2]。阿基瑞林为高端化妆品常用的原料之一，功效主要是减少由面部表情肌收缩造成的皱纹，对额头或眼睛周围的皱纹有理想的祛除效果[3-4]。另外，它还能促进胶原蛋白的生成，有助于肌肤组织重建。阿基瑞林是一种更安全、更廉价、温和的肉毒杆菌毒素替代品。

阿基瑞林作为一种新兴的药妆品原料，高昂的价格限制了其广泛应用。本研究在前期工作的基础上，对阿基瑞林的合成方法进行了优化，以期提高阿基瑞林粗肽的纯度，利于后期纯化，为工业化量产提供参考。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 AR224CN分析天平，美国奥豪斯仪器上海有限公司;制氮机，苏州华德气体设备有限公司;TDL-40B高速大容量离心机，上海安亭科学仪器厂;SHZ-Ⅳ循环水多用真空泵，南京科尔仪器设备有限公司;Heal Force 系列纯水机，香港力康公司;Agilent 1200液相，美国Agilent公司;Agilent1200系列高效液相-ESI质谱联用仪，美国Agilent公司。

1.2 主要材料 Rink-Amide 树脂，上海吉尔生化有限公司;1，2-二羟基苯并三氮唑(HOBT)、氨基酸原料，成都诚诺新技术有限公司;N-二异丙基碳二亚胺(DIC)，苏州昊帆高新技术有限公司;N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，天津星马克科技发展有限公司;三氟乙酸(TFA)，上海达瑞精细化学品有限公司;苯甲醚，天津福晨化工厂;甲基苯基醚、1,2-乙二硫醇(EDT)，阿拉丁试剂;无水吡啶、六氢吡啶、冰乙醚、乙腈、冰醋酸、甲醇，天津科密欧化学试剂有限公司;高纯水，实验室自制。

2 方法与结果

2.1 投料比的选择 取Rink Amide树脂溶胀，脱除Fmoc保护基[5]。HOBT:DIC:氨基酸(N:N:N)为1.2:1.2:1，树脂:氨基酸按照表1的投料比(N:N)反应，依次从N端到C端循环偶联氨基酸，合成完毕后，肽树脂真空减压干燥，称重。结果见表1:树脂:氨基酸投料比为1:3和1:4时，肽树脂增重差别不大，基于成本考虑，选择投料比为1:3。

表1 投料比对肽树脂增重的影响

2.2 裂解液体系的选择 取1g肽树脂缓缓加入表2的裂解液体系中，室温(25℃)裂解2h。过滤裂解液，滤液中缓慢滴加60ml冰乙醚，3200rpm离心10min，弃去上清液，重复4次，得到粗肽样品并干燥，检测粗肽纯度。结果显示，TFA:EDT:苯甲硫醚:苯甲醚=90:3:5:2为阿基瑞林适宜的裂解液体系。见表2:

表2 不同裂解液体系对粗肽纯度的影响

2.3 裂解时间的选择 取1g肽树脂缓缓加入到裂解液中，室温(25℃)按照表3中的时间裂解。过滤裂解液，滤液中缓慢滴加60ml冰乙醚，3200rpm离心10min，弃去上清液，重复4次;得到粗肽样品，干燥并检测粗肽纯度。结果显示，最佳时间为2.0h，时间缩短和延长粗肽纯度都有降低的趋势。见表3:

表3 裂解时间对粗肽纯度的影响

2.4 肽树脂与裂解液比例的选择 取1g肽树脂按照表4的比例(M:V)加入裂解液，室温(25℃)裂解2.0h。过滤裂解液，滤液中缓慢滴加60ml冰乙醚，3200rpm离心10min，弃去上清液，重复4次;得到粗肽样品，干燥并检测粗肽纯度。结果显示，最佳比例为1:12。见表4:

表4 肽树脂、裂解液比例对粗肽纯度的影响

2.5 EDT含量优化 取1g肽树脂按照表5加入EDT含量不同的裂解液，室温(25℃)裂解2.0h。过滤裂解液，滤液中缓慢滴加60ml冰乙醚，3200rpm离心10min，弃去上清液，重复4次;得到粗肽样品并干燥，检测粗肽纯度。结果显示，EDT含量增加到6%时对粗肽纯度的影响较大;但EDT含量增加到9%时的粗肽纯度反而低于6%时(表5)。因此，选择将裂解液的EDT含量增加到6%，可以更有效防止甲硫氨酸氧化。

表5 裂解液中EDT含量对粗肽纯度的影响

3 讨论

本研究通过单因素优化实验，确定了阿基瑞林合成最佳条件为树脂:氨基酸投料比为1:3，裂解液体系为TFA:EDT:苯甲硫醚:苯甲醚=87:6:5:2，肽树脂与裂解液比例1:12，室温(25℃)裂解2.0h，得到的粗肽纯度最高。

固相合成中由于原料昂贵，投料比、裂解液用量的优化有利于降低成本;合成含有甲硫氨酸等氨基酸的多肽，裂解时易发生氧化，调整裂解液体系中EDT含量有利于减少杂质，提高粗肽的纯度，从而降低纯化难度，对阿基瑞林的工业化生产具有参考意义。

[1]杜登学,王姗姗,周磊.肽类在化妆品中的应用[J].山东轻工业学院学报(自然科学版),2012,26(1):35-39.

[2]郭建维,钟星,徐晓健.药妆品胜肽的合成及作用机制研究进展[J].广东工业大学学报,2013,30(3):1-8.

[3]钟星,郭建维,成秋桂.胜肽在化妆品行业的应用和最新进展[J].日用化学品科学,2013,35(11):35-38.

[4]朱亮亮,绳则翠,陈英文,等.含有困难氨基酸序列Arg-Arg的醋酸阿基瑞林的固相合成及其动力学研究[J].高校化学工程学报,2013,27(5):791-797.

[5]刘璐,张莉,张庆云,等.正交设计法优化胸腺五肽固相合成工艺[J].武警医学院学报,2008,17(1):15-17.

Q517

A

1004-6879(2014)06-0509-02

2014-03-18)