单孢分离交配法提纯复壮杏鲍菇品种*

秦路宁 刘俊波 郑雪平 刘东波 夏志兰**



单孢分离交配法提纯复壮杏鲍菇品种*

秦路宁1刘俊波1郑雪平2刘东波1夏志兰1**

（1.湖南农业大学园艺园林学院，湖南 长沙 410128；2.北京市正兴隆生物科技有限公司，北京 昌平 102211）

通过对一个已退化的杏鲍菇品种进行单孢分离、交配，以及出菇试验找出最能体现杂种优势的配对孢子组，恢复最初的优良性状。结果从该杏鲍菇子实体中分离获得了11个单孢子；分别进行单孢交配，获得了12个配对组合。通过筛选，对其中6个组合进行出菇试验，内有3个交配组的生物学效率优于亲本，表明此方法收到了对杏鲍菇菌种进行提纯复壮的效果。

杏鲍菇；单孢分离；单孢交配；提纯复壮

杏鲍菇[(DC.ex Fr.)Qu l.]又名刺芹侧耳，其菌盖幼期呈半球状，色泽灰黑，成熟后菌盖平展，色渐淡，中心部位有近放射状黑色条纹，洁白，表面光滑；菌肉肥厚，嫩脆，具杏仁香味[1]。由于杏鲍菇是受双因子控制的四级性异宗结合菌类，其单孢子的杂交组会有3种表现型，即优质型、稳定型、劣质型[2]。实验目的在于挑选出优质、稳定的单孢交配组，以期达到提纯复壮的效果。

1 试验方法

1.1 杏鲍菇品种与来源

正兴1号品种，由北京正兴隆生物科技有限公司提供。

1.2 杏鲍菇孢子的收集

采集数朵约八成熟且菇盖稍大的杏鲍菇子实体，在菇体表面用无菌水冲洗、阴干，在超净工作台上把子实体固定在经灭菌的收集皿中并编号，放置于25 ℃室温环境中培养5～7天[3]。待弹射出足够的孢子后，将装有孢子的培养皿密封好，放入4 ℃冰柜中低温冷藏备用。

1.3 单孢分离的平板稀释分离法

在超净工作台上，用10～100 μL的移液枪吸取少量无菌水后从培养皿中粘取少量孢子粉注入1号三角瓶中，搅拌均匀；换用5 mL移液枪吸取5 mL悬液注入2号三角瓶，搅拌均匀。依此步骤稀释至第6号三角瓶，得到一组孢子悬液[4]。

依次从1至6号三角瓶中吸取少量悬液，于显微镜下观察，400倍单个视野中含2～3个孢子为最佳接种液。图1为单孢子显微镜形态示意图。

图1 单孢子

用1 mL移液枪从最佳稀释浓度的三角瓶中吸取0.5 mL悬液加到平板PDA培养基上并均匀涂布，倒置遮光培养2～3天，温度为25 ℃，待孢子萌发。

1.4 单核菌丝镜检

当孢子萌发成肉眼可见的“小菌落”时，立即转移到新的培养皿中。新菌落萌发至直径为3～4 cm时，置于显微镜下镜检，无锁状联合的为单核菌丝。单核菌丝白色，较稀，呈匍匐状，生长速度缓慢，平均为3.6 mm/d[5]。将各单核菌落取小块置于新培养皿中培养，待其长至直径为3～4 cm时，进行单孢交配。

1.5 单孢交配

在培养出的单核菌丝进行单孢交配前，按照稀释倍数依次命名。例如，从2号三角瓶中获得的单核菌丝，命名为2-1、2-2，以此类推。

在超净台上，取装有单核菌丝的培养皿2个，各用接种钩切取绿豆粒大小的菌块先后放入一个新的平板PDA培养基培养皿中，两菌块之间的距离以2～2.5 cm为最佳，放入25 ℃恒温培养室中避光培养。

1.6 双核菌丝筛选

将供试菌株从保藏试管中接到PDA培养基上于25 ℃环境下黑暗培养10 d；取菌落边缘直径为0.6 cm的菌块接于PDA平板上，25 ℃黑暗培养7 d，观察菌丝生长势及色泽。采用十字交叉法测量菌落直径，计算菌丝生长速度[6]。

将镜检选出的双核菌丝转入试管中培养至菌丝长满试管后，各取小块菌块接种至平板PDA培养基上测量生长速度。接种后每天观察菌块生长情况，记录菌丝的直径，以及生长时间。培养皿直径为90 mm，从接种至菌丝长满培养皿内的培养基为总时间，双核菌丝生长速度＝培养皿直径／总时间[7]。

1.7 交配组合出菇试验

培养料配方：木屑24%，甘蔗渣23%，玉米芯23%，麦麸18%，玉米粉5%，豆粕5%，轻质碳酸钙1%，石灰1%，pH值9，含水量65%。

菌丝长满袋后，进行搔菌、疏蕾、出菇管理及采收，记录鲜菇菌柄直径、长度、菌盖直径、菌总重量，以此计算杏鲍菇生物学效率。

2 结果与分析

2.1 交配组合的获得

试验结果包括孢子稀释分离情况、单核菌丝交配情况、双核菌丝筛选和出菇试验三个部分。从中筛选出菌丝生长速率最快，菇型最好和生物学效率最高的交配组。

在400倍显微镜下观察得到了第5号三角瓶为最佳稀释浓度的孢子悬液，单孢分离结果分别为：涂布培养皿总数18个，单孢子挑取总数13个，单核菌丝培养皿数11个。

由于孢子萌发需要诸多条件，包括孢子的生活力，培养基的营养水平，培养环境的温度等。孢子在平板涂布后的培养皿上成功萌发的几率偏低；单孢子挑取后通过镜检为单核菌丝的几率很高。

单孢交配情况如表1所示。

表1 单孢交配结果

注：1）表格中填入“—”的是交配失败的组合；2）表格中填入“×”的是重复试验；3）表格中填入“＋”的是交配成功的组合。

表2显示，最终单核菌丝交配后成功的组合有12个。

表2 双核菌丝生长速度

2.2 交配组合的筛选

双核菌丝生长速度测试结果如表2。正常培养条件下，杏鲍菇交配组合菌株间的菌丝日生长速度大概在8.30～10.00 mm之间[8]。本次试验选取了日生长速度在8.0 mm及以上的双核菌丝5-1×2、5-1×9、5-1×10、5-3×4、5-6×8、5-6×9这6个组合用作出菇试验（表3）。

表3 交配组合与杏鲍菇1号的出菇效果比较

2.3 交配组合的出菇试验

表3是筛选出的6个交配组合与亲本原品种杏鲍菇正兴1号进行比较的结果。

杏鲍菇生物学效率/%＝鲜菇总重／所用培养料干重×100。公式中鲜菇总重采用平均值，所用培养料干重每袋约420 g。从表3中可知，6个交配组合生物学效率仅5-3×4低于亲本，而5-1×2、5-1×9、5-6×8三个交配组合的生物学效率明显高于亲本。

2.4 分析

单孢交配成功的组合有小部分性状比亲本差。因为单孢交配能获得三类菌株性状类型：优质型、稳定型、劣质型。单孢交配获得的6个杏鲍菇交配组合在生物学效率上普遍都比亲本高，说明对杏鲍菇菌株进行提纯复壮是一项简单有效的育种技术，能提升菌种质量，提高生物学效率。单孢交配成功的几率很低的原因是两个同一品种分离出来的孢子交配，受亲和关系及性别因素的影响。

单孢交配后获得的交配菌株与亲本是否相同，可以通过以下4个方法鉴别：一是观察杂种菌丝有无锁状联合；二是进行拮抗实验，观察杂种与亲本有无拮抗线；三是进行DNA鉴定，观察杂种与亲本的亲缘关系；四是进行出菇试验，观察能否结实及子实体生长状况[9]。优良的菌种体现在两方面：一是种性好，高产优质，抗逆性强；二是纯度高，无病虫害感染[10]。交配组合菌丝生长速度测试和出菇试验证明了单孢分离交配技术对提纯复壮杏鲍菇退化品种的可行性和有效性。

[1] 黄年来. 18 种珍稀美味食用菌栽培[M]. 北京: 中国农业出版社, 1997: 1-157.

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[3] 陈娟, 苏开美. 食用菌育种及种质鉴定进展[J]. 中国食用菌, 2008, 27(5): 3-8.

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[5] 冯伟林, 蔡为明, 金群力, 等. 杏鲍菇担孢子交配型的鉴定分析[J]. 浙江农业学报, 2010, 22(1): 102.

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[10] 潘崇环, 马立验, 韩建明, 李沫. 食用菌栽培新技术图表解[M]. 北京: 中国农业出版社, 2011: 1-3.

Purification and Rejuvenation of DegeneratedStrain by Single Spore Mating*

Qin Luning1, Liu Junbo1, Zheng Xueping2, Liu Dongbo1, Xia Zhilan1

(1.College of Horticulture and Landscape, Hunan Agricultural University, Hunan Changsha 410128; 2.Peking Zheng XinglongBiotechnology Limited Company,Peking Champin 102211)

The experiment on single spore of a degradedvariety which isolation and pairing, is to identify the best monospore combination of heterosis, and restore the originally excellent characters of the variety. The experiment result expresses, 11 monospores were isolated, 12 combinations were obtained through monosporous hybridization, respectively, from the sporocarp of thisvariety. By making the mushroom experiments of 6 combinations, which prove that biological efficiency of three hybrid combination is better than parent,strains reached the effect that purification and rejuvenation with this method.

; separation of single spore; single spore hybrid; purification and rejuvenation

S646.1

A

2095-0934（2014）01-048-03

“十二五”农村领域国家科技计划课题，食用菌新品种培育及制种关键技术研究（2013BAD16B02）

E-mail: 695218379@qq.com。