DNA条形码技术鉴定我国部分白蛉蛉种

周正斌，张 仪，吕 山，施文琦，金长发，朱淮民

白蛉属于双翅目毛蛉科白蛉亚科(Phlebotominae)，是一类体小多毛的吸血昆虫，全世界已知800多种，其中约10%蛉种已被证实可传播利什曼病等多种疾病[1-2]。特定的蛉种只能传播特定种类的利什曼原虫。传统形态学蛉种鉴定存在局限性，其受发育状态的限制。白蛉主要依据成虫的内部解剖结构、外部形态，或者雄虫外生殖器的形态特征进行蛉种鉴定，卵、幼虫、蛹等非成虫虫态一般难以鉴定。肢体残缺的成蛉很容易造成种类鉴定不准确或者无法鉴定。而培养一个传统的分类工作者往往需要数年的专业培训，不断缩减的分类学家队伍，使分类学发展面临巨大的挑战。DNA条形码技术是利用分子标记的序列差异将物种鉴定到种水平的一种方法[3]，在物种鉴定方面显示了独特的优势[4]。目前DNA条形码技术已被广泛应用于昆虫物种的鉴定[5-7]。然而国内利用DNA条形码技术进行蛉种鉴定的报道并不多，本文旨在探索基于COI基因的DNA条形码技术是否可以用于我国常见蛉种的鉴定。另外，通过分析种内种间的序列差异，确定白蛉种内、种间及属间关系，为白蛉DNA条形码的研究提供依据。

1 材料与方法

1.1材料 供试白蛉样本采集地、样本数、序列数和GenBank登录号或者序列号见表 1。

表1 本研究中所用蛉种

1.2白蛉形态学鉴定 取白蛉的头部和尾部，以10% KOH消化后，根据白蛉的咽甲、受精囊或者雄性尾器特征鉴定其种类[9-10]。余下部分用于提取基因组DNA。

1.3分子试验方法 按照Krueger等[11]方法单只白蛉提取基因组DNA，扩增线粒体COI基因按照Hebert等[12]方法。对样本进行扩增，在2%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。克隆和测序:利用AXYGEN回收试剂盒(Axygen Scientific，Inc.，USA)对PCR产物进行纯化，由上海生工公司进行序列双向测定，以它们的一致序列为准。并用DNSP软件包筛选单倍型。

1.4假基因甄别 本文所使用的43条COI基因序列(长度663 bp)阅读框完整，没有出现碱基的缺失和插入现象，所有序列均能翻译成氨基酸序列，说明未被核基因中的假线粒体基因序列干扰。

1.5系统发生分析 获得的DNA序列先提交至GenBank数据库中，然后用BLAST工具进行序列分析、DNA序列检索；用Genedoc软件进行序列同源性比较；用BioEdit软件进行序列编辑;用ClustalX[13]软件进行序列比对；比对结果输入MEGA 4[14]软件，采用距离法计算序列间的遗传距离，并基于Kimura 2-parameter模型，用邻接法构建系统发育树，通过1 000次检验获得系统树分支的置信度。用DAMBE 5.1.2[15]软件分析核苷酸取代的饱和度。

2 结 果

2.1基于COI的序列差异及饱和度分析 本试验研究了来自白蛉亚科3个属9物种线粒体COI部分片段。这是一段基因片段长663 bp的片段，无碱基的插入和缺失，变异位点218个，占32.9%；简约信息位点204个，占30.8%。序列的碱基组成：A：28.8%，G：16.1%，C：17.3%，T：37.9%，AT平均含量66.7%。经过MEGA4的计算，9个物种的两两核苷酸差异统计结果(表2)显示各蛉种种内线粒体COI核苷酸遗传距离均小于2%，种内核苷酸遗传距离0.2%～1.6%，种间核苷酸遗传距离5.9%～17.2%，种间遗传距离远远大于种内遗传距离。属间核苷酸遗传距离12.0%～14.8%，见表3。

表2 白蛉COI序列的种间遗传距离

表3 白蛉COI 序列的属内属间遗传距离

将线粒体COI基因序列成对比较，推断的碱基替代数同GTR距离进行比较来验证白蛉COI基因中是否存在突变饱和现象。线粒体COI基因序列位点转换(S)和颠换(V)序列差异散点图(图1)显示，颠换未发生突变饱和，但转换表现出明显的饱和现象。

2.2基于COI构建的系统发育树 本研究一共获得我国白蛉亚科9个物种的43条线粒体COI序列。以筠连秦蛉的COI序列为外群，通过1 000次重复抽样检验获得系统树分支的置信度，9蛉种都以较高的置信度各成一个进化支，但亚属内物种的系统发生关系并没有被很好地确定，如图2所示。

图1 白蛉亚科9蛉种的转换(S)、颠换(V)数目和基于GTR模型的COI基因序列遗传距离成对比较所得的遗传距离散点图

3 讨 论

本文探讨了COI基因用于我国常见蛉种鉴定的DNA 条形码技术及系统发育问题。

加拿大动物学家Hebert[3]等对动物界，包括脊椎动物和无脊椎动物共11门13 320个物种的线粒体细胞色素C氧化酶亚基基因序列比较分析，除腔肠动物Cnidaria外，98%的物种遗传距离差异在种内0%～2% ，种间平均可达到11.3%。本研究表明，种内的个体间差异远远小于 Hebert 等提出的2%的标准，种间遗传距离平均为11.1%，远远大于种内遗传距离，线粒体COI的序列数据和NJ树支持了形态学上鉴定的种的地位，如图2(A)。由于COI序列核苷酸取代饱和，这可能影响了高阶元属的分类结果，当只取COI序列编码蛋白密码子的第一、二位核苷酸构建进化树时，不同属的物种可以清楚地区分开来，如图2(B)。DNA条形码与DNA分类是不同的。虽然DNA条形码也用系统发育分析树来做分析，但仅仅是为了验证物种的单源性和聚类关系，通常要求所用分析方法简洁、快速，所以这些树并不能看做系统发育树。而DNA分类在为物种鉴定提供平台的同时，还需要探讨物种的系统发育、高阶元分类地位等深层次的问题，并且要用到多种软件、多种算法构建系统发育树，运算较复杂。本研究显示在亚属水平上基于线粒体COI序列的NJ树与形态学分类有差异，如在传统形态学中冷氏白蛉、吴氏白蛉同属白蛉属劳蛉亚属，亲缘关系较近[16]，但是以p-distance计算冷氏白蛉与吴氏白蛉种间遗传距离(0.151)大于冷氏白蛉与阿蛉亚属中华白蛉间的遗传距离(0.059)，以NJ法构建的分子进化树也显示了相同的结果。本研究DNA条形码为DNA分类提供了部分数据，可以作为DNA分类系统的初步实践，但对于我国白蛉DNA分类有待于进一步深入研究。

图2 基于43条白蛉COI序列所构建的系统发育树

在分子进化过程中，由mtDNA片段转移到核序列中而形成的细胞核线粒体假基因(Numts)广泛存在于无脊椎动物细胞中。Numts序列和目的mtDNA序列协同扩增将严重影响DNA条形码研究。但通过采用多种方法可以避免和解决Numts的扩增问题，如利用是否存在电泳杂带、测序双峰、背景噪音等现象而无法获取目的序列等现象可以初步判断PCR产物中是否存在Numts。Numts一般含有阅读框内终止密码子、插入缺失或点突变位点等，对获得条形码序列对序列进行分析，通过检测成分偏向性，是否能正确翻译以及与相近种序列比对可以确定序列是否为目的COI序列[17]。此外采用RT-PCR技术或设计特异引物对物种进行特异扩增将有效避免这一问题[18-19]。

线粒体基因属于母系遗传，可能会由于种间线粒体基因交流出现一些导致错误鉴定的现象。比如:种间杂交和内共生菌(如:沃尔巴克wolbachia)感染，所导致的对线粒体基因的间接选择[20]。目前国内尚未见白蛉wolbachia感染的报道，但以色列、埃及境内的Phlebotomuspapatasi中已发现沃尔巴克菌感染[21]。沃尔巴克等内共生菌的存在，会造成寄主 mtDNA 多态性降低或提高，从而影响基于mtDNA的 DNA 条形码及系统发育研究。因此在解决一些特殊类群，或处理一些特殊情况如假基因、基因交流等时，需要再加一条候补基因如核基因等[22]。选取多个基因共同用于物种鉴定不仅能丰富分子分析数据，而且能使鉴定与分析更为准确。

DNA 条形码不能取代形态学分类，而是二者相辅相成，DNA 条形码数据能引导形态数据分析更为仔细。显著的 DNA 条形码差异与形态学特征以及生态学等研究相结合才能在物种鉴定中取得最有效的结论。综上所述，基于线粒体 COI 基因的 DNA 条形码在白蛉蛉种的种、属水平上可以很好的区分，可以作为一种有效的工具在白蛉物种鉴定中进行应用。

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