福建省临床分离非结核分枝杆菌菌种分布研究

黄明翔，万康林，陈力舟，张丽水，李 丹

非结核分枝杆菌(NTM)是指结核分枝杆菌复合群及麻风分枝杆菌以外的分枝杆菌，种类繁多，至今已发现150余种。NTM广泛存在于环境中，其中大部分为腐物寄生菌，仅少部分对人体致病。NTM可以侵犯人体肺脏、淋巴结、骨骼、关节、皮肤和软组织等组织器官并可引起全身播散性疾病。近年来，NTM的分离率和发病率呈上升趋势，2010年第5次全国结核病流行病学调查表明，NTM 分离率为22.9%，较1990年的4.9%明显上升[1]。为了解福建省临床分离菌株中NTM的菌种类型分布情况，我们对我院2009年1月-2012年12月分离的6 362株分枝杆菌菌株进行菌群鉴定，对鉴定为NTM的菌株应用PRA-hsp65和PRA-rpoB进行菌种鉴定，结果报道如下。

1 材料方法

1.1材料

1.1.1菌株来源 标本来源于我院2009年1月-2012年12月经BACTEC MGIT 960 培养分离出分枝杆菌菌株6 362株。分枝杆菌标准株来源于中国药品生物制品检定所和美国ATCC，所有菌株均由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所结核病室传代培养、保藏，并提供作为参照。

1.1.2试剂 限制性内切酶、DNA Ladder 购自日本TaKaRa公司，2×Taq MasterMix 、DNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司， Metaphor®低分子量琼脂糖购自美国Lonza公司。罗氏培养基(L-J)、对硝基苯甲酸(PNB)、噻吩-2-羧酸肼(TCH)培养基由本实验室按2006年中国防痨协会出版的《结核病诊断实验室检验规程》要求配制。

1.2方法

1.2.1分枝杆菌培养及菌群鉴定 分枝杆菌培养采用BACTEC MGIT 960系统、改良罗氏法；结核分枝杆菌复合菌与NTM分群主要通过对硝基苯甲酸 (PNB) 生长试验、耐热触酶试验、28 ℃生长试验和观察菌株的菌落形态、颜色等生物特征进行区分[2]。

1.2.2细菌DNA的制备 将分枝杆菌菌群鉴定为NTM的菌株接种于L-J培养基，取少量培养物加生理盐水中，80 ℃灭活30 min，12 000 r/min离心5 min，弃上清，菌体沉淀用400 μL TE重悬，加入50 μL 10 mg/mL溶菌酶，37 ℃孵育16～20 h。之后按DNA提取试剂盒说明操作，最后用200 μL TE溶解DNA沉淀，-20 ℃保存备用。

1.2.3PCR扩增 根据参考文献分别用引物tb11， tb12[3]和rpoBF，rpoBR[4]扩增hsp65和rpoB，均由上海生工生物技术有限公司合成。两对引物分别是tb11(5′ACC AAC GAT GGT GTG TCC AT 3′)和tb12(5′CTT GTC GAA CCG CAT ACC CT 3′)扩增长度441bp的hsp65基因片段 ，rpoBF(5′TCA AGG AGA AGC GCT ACG A 3′)和rpoBR(5′GGA TGT TGA TCA GGG TCT GC 3′)扩增长度380 bp的rpoB基因片段。PCR反应体系均为50 μL，包括2×Taq Master Mix 25 μL， DNA模板5 μL，引物各2 μL，灭菌蒸馏水(ddH2O)16 μL。PCR扩增条件：94 ℃预变性10 min，94 ℃变性1 min，退火65 ℃ 45 s ，72 ℃延伸1 min，30个循环，最后72 ℃延伸10 min。

1.2.4hsp65和rpoB基因PCR-RFLP 分别用BstP I和HaeIII酶对hsp65基因片段进行酶切，rpoB基因片段分别用MspⅠ和HaeⅢ两种内切酶进行酶切。两种内切酶的反应总体积均为20 μL：内切酶 1 μL，PCR产物15 μL，缓冲液2 μL，ddH2O 2 μL，酶切最适温度下(BstP I为60 ℃，MspⅠ和HaeⅢ为37 ℃)，孵育2 h。酶切产物经4% Metaphor琼脂糖凝胶电泳。酶切图谱分析采用BIO-RAD公司的凝胶成像仪配套的Image Lab软件。

2 结 果

2.1分枝杆菌菌群鉴定结果 2009年1月-2012年12月我院共收集到6 362株分枝杆菌临床分离株，经菌群鉴定5 713株结核分枝杆菌复合群(占89.8%)，649株为NTM(10.2%)。福建地区NTM 的临床分离率为10.2%。

2.2hsp65及rpoB基因 PCR-RFLP结果hsp65基因扩增后分别进行BstpI和HaeIII酶切；rpoB基因扩增后分别进行MspⅠ和HaeⅢ酶切，标准参考菌株及临床菌株都获得了清晰的RFLP酶切指纹图谱，电泳结果见图1，2。

图1 hsp65基因扩增产物酶切鉴定图谱

2.3PRA-hsp65及PRA-rpoB菌种鉴定结果 通过以上hsp65 PCR-RFLP及rpoBPCR-RFLP指纹图谱与参考文献[4-5]的比较，649株NTM菌株共鉴定出24个菌种，菌种分离数量前5位的是胞内分枝杆菌、鸟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、戈登分枝杆菌和马赛分枝杆菌M.massiliense亚种。鉴定结果见表1。

图2 hsp65基因扩增产物酶切鉴定图谱

表1 405株NTM菌种鉴定结果

3 讨 论

人类分枝杆菌感染的主要病原菌是结核分枝杆菌,但是近年来随着结核病疫情的控制，NTM病的患病率却呈上升趋势[6]，这可能与实验室菌种鉴定水平的提高、人口老龄化、免疫抑制人群增多以及环境暴露的増加均有一定的关联。我国5次结核病流行病学调查显示，NTM在分枝杆菌中的分离率逐年上升。

NTM的感染发生率和菌种分布存在着地域差异，且与气候环境相关，第3次结核病流行病学对各地NTM感染情况调查表明NTM的感染率呈现出南方高于北方，沿海高于内地，气候温和地区高于寒冷地区的流行特点。福建省地处中国东南沿海，气候温暖潮湿，第4次全国结核病流行病学抽样调查显示NTM感染率为37.7%，属于NTM感染的高发区。本研究结果显示：2009-2012年福建省NTM临床分离率为10.2%，与国内景辉等[21]报道相比，福建省的NTM分离率远高于同期山东省的1.37%；与同样地处沿海地区广州的2009年NTM分离率19.3%相比，则略低于广州地区。福建省较高的NTM临床分离率应当引起我们的重视，对于分枝杆菌菌株应进行快速准确的MTBC与NTM的鉴别，以避免临床对NTM感染患者给予常规抗结核治疗，因为大量研究以及临床治疗经验表明多数传统抗结核药物对NTM病很少或没有活性。

本研究应用PCR-RFLP对619株NTM进行菌种鉴定，相较于传统方法以PCR为基础的分子生物学方法具有简便、快速、灵敏、特异的特点，已在国内外实验室开展研究，结果均证实分子生物学方法能将大多数分枝杆菌鉴定到种，优于传统方法，对提高分枝杆菌的正确诊断率、指导临床合理用药有重要意义[7]。

经PCR-RFLP检测分析，我们从649株NTM菌株中鉴定了24个菌种，菌种数量前5位的是胞内分枝杆菌、鸟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、戈登分枝杆菌和马赛分枝杆菌M.massiliense亚种。Ⅲ群的鸟分枝杆菌复合群(MAC)为福建省NTM的主要分离菌种，占总数的67.8%。其次为Ⅳ群快生长菌(RGM)包括脓肿分枝杆菌(81株)、、马赛分枝杆菌及其亚种(32株)、偶然分枝杆菌(18株)、脓毒分枝杆菌及其亚种(5株)、龟分枝杆菌(3株)、摩纳哥分枝杆菌及其亚种(3株)、荷斯坦分枝杆菌(1株)，占总数的22.0%。本研究结果与Simons等[8]报道相一致，Simons等对有关东亚NTM病的流行病学以及临床特征的30篇英文文献进行荟萃分析发现，在东亚地区MAC肺病最常见占67.2%，其次为RGM病为16.4%。中国有很多关于NTM流行情况的报道。2000-2008年在与福建气候条件较为接近的台湾，致病性的NTM中MAC占首位为30.0%，其次为RGM包括脓肿分枝杆菌(17.5%)和偶然分枝杆菌(13.0%)[9]，通过比较,我们发现虽然台湾NTM的主要致病菌种也是MAC和RGM，但台湾的RGM所占比例要高得多，特别是偶然分枝杆菌，其在福建仅占2.2%。WANG HX等[10]报道，上海在2005-2008年间，共分离出248株16个菌种NTM，分离率前3位菌种分别为龟分枝杆菌26.7 %，偶然分枝杆菌15.4%，堪萨斯分枝杆菌14.2%，而MAC分离率仅13.1%排第4。另有研究显示山东地区NTM以MAC为主，占总数的80.6%，其他菌种相对比较少[11]。与上海、山东相比，福建NTM菌种分布具有本地区的特点：较上海较高的龟分枝杆菌分离率，福建则较少见，仅为0.46%；山东省除MAC外，其它菌种少见，而福建呈现菌种分布类别广的特点。这些研究表明了NTM 的流行有显著的区域性差异。

NTM菌种快速、准确鉴定对于临床疾病的诊断和治疗是十分重要的，美国2007年“NTM病诊断，治疗与预防的指南”[12]中明确指出临床分离的NTM必须鉴定到种水平。另外，由于目前国内还没有制定NTM的药敏试验的参考方法，药敏试验尚处于科研阶段，多数医院没有开展NTM的药敏试验，对于NTM病的治疗多采用经验治疗，因此NTM菌种鉴定就显得十分重要。本研究表明，PCR-RFLP可以快速、准确将NTM鉴定到种水平。

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中国防痨协会基础专业委员会. 结核病诊断实验室检验规程[M]. 北京:中国教育文化出版社,2006:53-55.

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