响应曲面法优化山楂总黄酮提取工艺

蔡向杰，冯玉康，程翠娜

(神威药业集团有限公司，河北 石家庄 051430)



响应曲面法优化山楂总黄酮提取工艺

蔡向杰，冯玉康，程翠娜

(神威药业集团有限公司，河北 石家庄 051430)

目的：优化山楂总黄酮提取工艺。方法：以乙醇为提取试剂，在单因素试验的基础上，应用Box-Behnken 设计方法建立数学模型，选择乙醇浓度、提取时间、提取温度、提取次数为影响因子，以山楂总黄酮含量为响应值，进行响应曲面分析。结果：最佳工艺条件：乙醇浓度为80%，提取温度为55℃，提取时间为2.5h，提取次数为3次，山楂总黄酮含量可高达16.085 3mg/g。结论：提取工艺与设计模型高度拟合，可用于工业生产，提高山楂总黄酮提取率。

山楂；总黄酮；响应曲面法；工艺优化

山楂为蔷薇科山楂属植物山里红CrataeguspinnatifidaBge.var.major N.E.Br.或山楂CrataeguspinnatifidaBge.的干燥成熟果实，为药食同源植物。药理研究表明，山楂主要含有机酸和黄酮类化合物[1]，黄酮类化合物能扩张冠状动脉，改善微循环，抗动脉粥样硬化[2]，临床试验证明其疗效显著且安全无毒副作用。因此，山楂总黄酮的研究开发具有重要的经济价值和社会效益。本试验以山楂为研究对象，采用有机溶剂为溶媒，利用响应曲面法优化山楂总黄酮的提取工艺条件，现报道如下。

1 材料与仪器

1.1 药材与试剂

山楂：购于平邑县原田金银花专业合作社，经鉴定为山楂CrataeguspinnatifidaBge.的干燥果实。芦丁对照品：中国食品药品检定研究院，批号：100080-200707，纯度为92.5%。其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器

岛津紫外可见分光光度计UV-2550；AL204电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司，0.1mg)。

2 方法与结果

2.1 山楂提取工艺

取一定量山楂，加入10倍量一定浓度的乙醇加热回流，多次提取，过滤合并上清液，回收溶剂，浓缩为浸膏。

2.2 山楂总黄酮含量测定方法

2.2.1 对照品溶液制备 精密称取于120℃干燥至恒重的芦丁对照品25mg，置于50mL容量瓶中，加乙醇适量，超声30min使之溶解，放冷，加乙醇至刻度，摇匀，精密量取20mL上述溶液置于50mL容量瓶中，加水至刻度，即得0.2mg/mL对照品溶液[3]。

2.2.2 芦丁标准曲线绘制 精密量取芦丁对照品溶液1、2、4、6、8、10mL，分别置于25mL容量瓶中，各加入70%乙醇至10mL。加5%亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，放置6min；加10%硝酸铝溶液1mL，摇匀，放置6min；后加1.0mol/L氢氧化钠溶液10mL，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，放置15min。以不加芦丁的对照品溶液为空白，采用分光光度法于500nm[4]波长处测定吸光度，以芦丁浓度C为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程为：A=6.272 6C+0.204 1(r = 0.999)，线性范围为0.008～0.08mg/mL。

2.2.3 样品溶液制备 精密称取山楂浸膏25mg，用60%乙醇定容至25mL。精密量取2mL溶液，用60%乙醇定容至10mL，作为样品溶液。精密量取样品溶液5mL，按照标准曲线制备方法进行试验。

2.3 提取试剂选择

取20g山楂，分别用10倍量甲醇、乙醇、乙酸乙酯和丙酮按照“2.1”项工艺流程浸提，比较4种有机溶剂对总黄酮的提取效果。结果表明乙醇提取效果最好，总黄酮含量为15.776 2mg/g，甲醇次之，丙酮最差，故选乙醇为提取试剂。

2.4 单因素试验

2.4.1 乙醇浓度 设定提取温度为70℃，提取时间为2h，提取次数为3次，分别考察10%、30%、50%、70%、90%乙醇溶液对总黄酮含量的影响[5]。结果表明，用70%乙醇提取时山楂总黄酮含量最高。

2.4.2 提取时间 设定提取温度为70℃，提取溶剂为70%乙醇，提取次数为3次，分别考察1、2、3、4h提取时间对总黄酮含量的影响。结果表明，提取时间为3h时总黄酮含量最高。

2.4.3 提取温度 设定提取溶剂为70%乙醇，提取时间为3h，提取次数为3次，分别考查40、50、60、70、80℃提取温度对总黄酮含量的影响。结果表明60℃下提取山楂总黄酮含量最高。

2.4.4 提取次数 设定提取溶剂为70%乙醇，提取温度为60℃，提取时间为3h，分别考查1、2、3、4、5次提取次数对总黄酮含量的影响。结果表明，提取3次时总黄酮含量最高。

2.5 响应曲面试验

在单因素实验的基础上，根据Box-Behnken的中心组合设计原理设计自变量，以总黄酮含量为响应值，通过响应曲面分析进行工艺优化。

2.5.1 因素选择 在单因素试验的基础上，确定了各因素最适宜的条件，根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，设计四因素三水平的响应面分析试验。

2.5.2 响应曲面试验 采用Design-Expert8.0.5软件进行试验设计，具体结果如表1所示。

2.6 模型建立及显著性检验

利用Design-Expert8.0.5软件对试验数据进行多元回归拟合分析，得到山楂总黄酮含量与各因素变量的二次方程模型为：

Y=15.68+0.069X1-0.17X2+0.16X3-0.67X4+0.28X1X2-1.00X1X3-0.30X1X4+0.64X2X3+0.59X2X4+0.38X3X4+0.039X12-0.17X22-0.68X32-1.47X42

由方差分析结果可知，试验所选模型P<0.000 1，表明回归模型极显著，失拟项P=0.836 9>0.05不显著，说明数据中没有异常点，不需要引入更高次数的项。各因素对山楂总黄酮含量的影响从大到小依次为提取次数、提取时间、提取温度、乙醇浓度。由响应分析结果可知，最佳提取条件为乙醇浓度80%，提取温度56.2℃，提取次数3次，提取时间2.5h。

2.7 响应曲面模型验证

为验证响应面优化山楂提取条件结果的可靠性，同时为了计算方便，得出最终提取条件为乙醇浓度80%，提取温度55℃，提取次数3次，提取时间2.5h。在此条件下连续进行了3次试验，得出山楂总黄酮的含量分别为16.012 5 mg/g、16.107 9 mg/g、16.135 4mg/g，平均值为16.085 3mg/g，RSD=0.4%，表明基于响应曲面法的山楂总黄酮提取条件准确可靠。

表1 响应面试验设计及结果

3 结论

采用Design-Expert 8.0.5软件设计响应面试验，并进行试验验证，得出山楂总黄酮的最佳提取工艺条件为乙醇浓度80%，提取温度55℃，提取次数3次，提取时间2.5h。提取工艺与模型高度拟合，可用于工业生产，提高山楂总黄酮提取率。

[1] 李贵海,孙敬勇,张希林,等.山楂降血脂有效成份的实验研究[J].中草药,2002,33(1):50-52.

[2] 高莹,肖颖.山楂及山楂黄酮提取物调节大鼠血脂的效果研究[J].中国食品卫生杂志,2002,14(3):14-16.

[3] 张妍,李厚伟,张永春,等.山楂中总黄酮几种分离方法的考察及含量测定[J].哈尔滨医科大学学报,2001,35(3):183-184.

[4] 张海英,薛洁.山楂总黄酮提取工艺的研究[J].新疆中医药,2006,24(5):17-18.

[5] 马桂芝,云琦,高晓黎.大豆中大豆异黄酮提取工艺的研究[J].中成药,2002,24(11):828-831.

(责任编辑：尹晨茹)

2014-03-13

蔡向杰(1984-)，女，神威药业集团有限公司助理工程师，研究方向为制药工艺技术。

R284.2

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1673-2197(2014)12-0025-02