合并乙肝病毒感染对弥漫大B细胞淋巴瘤患者细胞免疫功能的影响

复旦大学附属中山医院血液科，上海 200032

合并乙肝病毒感染对弥漫大B细胞淋巴瘤患者细胞免疫功能的影响

魏征 程韵枫 王志梅 邹善华

复旦大学附属中山医院血液科，上海 200032

邹善华，副主任医师，副教授，复旦大学附属中山医院血液科副主任，中华医学会上海分会血液学专科委员会委员兼秘书，中国淋巴瘤联盟委员；兼任《中华血液学杂志》通讯编委及《实用内科学》第14版编委。主要从事血液肿瘤临床和相关研究工作。参编专著8部，在国内外期刊上发表论文40余篇。

背景与目的：乙型肝炎病毒(hepatitis virus B，HBV)感染与弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma，DLBCL)密切相关，前期研究发现在接受联合免疫化疗的DLBCL患者中，HBsAg阳性者生存较差，但具体机制有待进一步证实。本研究通过分析HBV感染对DLBCL患者细胞免疫的影响，为阐明这一机制寻找细胞免疫方面的证据。方法：2004年3月—2013年6月共294例住院初治的DLBCL患者纳入本研究。采用四色流式分析患者外周血CD3+、CD4+、CD8+细胞计数及CD4+/CD8+细胞比例，比较HBsAg阳性及阴性的DLBCL患者发病时、化疗后2～4个月、化疗后4～6个月及化疗后6～12个月上述参数的时序改变及2组间的差异。结果：与HBsAg阴性患者相比，HBsAg阳性DLBCL患者化疗前各淋巴细胞亚群差异无统计学意义(P＞0.05)；外周血CD4+细胞计数在化疗后2～4个月显著低于HBsAg阴性患者；HBsAg阳性患者CD4+/CD8+比例降低，在化疗后4～12个月显著低于HBsAg阴性患者。结论：合并HBV感染对DLBCL患者化疗前细胞免疫状态无明显影响；HBsAg阳性的DLBCL患者化疗后出现更为明显和持续的细胞免疫抑制。

弥漫大B细胞淋巴瘤；细胞免疫；化疗

弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma，DLBCL)是我国最常见的淋巴瘤病理亚型；在DLBCL患者中，乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染率明显高于其他恶性肿瘤乃至淋巴造血系统恶性肿瘤，包括T细胞淋巴瘤及滤泡淋巴瘤等［1-5］。前期研究证实HBsAg阳性的DLBCL患者在接受联合免疫化疗后，获得与HBsAg阴性患者类似的缓解率，但长期预后较差［6］。HBV慢性感染患者存在细胞免疫功能削弱，CD4+细胞减少，CD4+/CD8+比例降低的现象［7-8］；但HBV感染的DLBCL患者在化疗过程中细胞免疫变化情况尚不明确。本研究通过分析HBsAg阳性及阴性的DLBCL患者化疗前后细胞免疫差异，探索合并HBV感染对DLBCL患者细胞免疫影响的规律，为进一步阐述HBV感染对DLBCL患者预后影响的机制建立理论基础。

1 资料和方法

1.1 患者资料

顺序收集2004年3月—2013年6月，复旦大学附属中山医院血液科住院化疗的294例DLBCL患者，其中乙肝表面抗原(HBsAg)阳性59例，HBsAg阴性235例。该回顾性研究获复旦大学附属中山医院伦理委员会批准。

入选标准：①复旦大学附属中山医院病理确诊为DLBCL的初治患者；②年龄≥16岁；③具有完整的HBsAg及乙肝核心抗体(HBcAb)初筛及随访资料；④完成治疗前及治疗后至少2次外周血淋巴细胞亚群分型检测；⑤采用CHOP样方案(环磷酰胺、表柔比星、长春地辛及泼尼松)或 R-CHOP样方案(CHOP样方案联合利妥昔单抗)初始治疗6～8个疗程。

排除标准：①合并HCV感染及HIV感染；②原发性中枢神经系统淋巴瘤。

1.2 临床评价及治疗

所有患者在化疗前接受HBV血清标志物检测，包括至少HBsAg及HBcAb。病理诊断由病理科根据WHO淋巴造血肿瘤诊断标准确诊为DLBCL［9］。病理亚型主要根据Bcl-6、CD10及Mum-1染色区分为生发中心型(germinal center B-cell like, GCB)、非生发中心型(non-germinal center B-cell like，non-GCB)［10-11］；以及其他少见的特殊亚型及无法分类的患者，包括由其他淋巴瘤亚型转化而来的转化型弥漫大B细胞淋巴瘤(transformed DLBCL，t-DLBCL)。治疗前通过CT或PET-CT判断病灶累及范围及病灶最大径，记录原发病灶位置(淋巴结或结外)及评估结外病灶数目，骨髓穿刺涂片及活检病理判断有无骨髓累及；使用Ann-Arbor 分期对患者进行分期分组，并使用国际预后指数(International Prognosis Index, IPI)评分［12］。

所有患者均接受改良CHOP样或R-CHOP样方案进行初始诱导治疗，具体为CHOP方案：环磷酰胺(750 mg/m2，第1天，静脉滴注)；长春地辛(2.8 mg/m2，截顶剂量4 mg/m2，第1天，静脉滴注)；表柔比星(70 mg/m2，第1天，静脉滴注)，以及泼尼松(70 mg/m2，第1～5天，口服)联合化疗，21 d为1个疗程；采用R-CHOP方案者在CHOP方案基础上联用利妥昔单抗(375 mg/m2，第0天，静脉滴注)。

1.3 主要材料

四色流式检测试剂盒MultiTEST IMK Kit购自BD公司(anti-CD3 FITC/anti-CD8 PE/anti-CD45PerCP/anti-CD4APC；anti-CD3 FITC/ anti-CDl6+CD56 PE/anti- CD45 PerCP/ant-CDl9 APC)

1.4 淋巴细胞亚群分型检测

患者首次化疗前及常规疗程化疗前，EDTA抗凝管抽取清晨空腹静脉血2 mL，进行四色抗体标记检测并由FACS Calibur流式细胞仪上机检测，BD FACS Diva软件分析，得到CD3、CD4、CD8和CD19阳性细胞占淋巴细胞比例，并计算CD3、CD4和CD8阳性细胞绝对计数待进一步分析。根据检测时点，将检测数据分为化疗前、化疗后2～4个月、4～6个月及6～12个月的结果，在同一检测时间区间内多次结果取最末一次检测结果进行分析。

1.5 统计学处理

所有数据采用SPSS 19.0进行统计分析。各组患者的一般临床特征作为分类资料，使用χ2检验比较组间差异。各组患者白细胞计数、淋巴细胞亚群分类比例及绝对计数等计量资料以表示，以F检验确定数据正态性，独立样本t检验比较2组数据间均值；不符合正态分布的数据采用Wilcoxon秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 患者基线情况

将HBsAg阳性及阴性DLBCL患者发病时各项临床特征进行比较，包括年龄、性别、临床分期分组、IPI分组、起病部位(淋巴结或结外)，病理亚型(生发中心来源或非生发中心来源、或转化型DLBCL及其他少见或无法分类亚型)以及初治方案不同。各临床特征在组间比较差异无统计学意义(表1)。

2.2 外周血淋巴细胞亚群在DLBCL患者化疗不同阶段的变化

将HBsAg阳性及阴性DLBCL患者化疗过程中不同阶段外周血T淋巴细胞亚群计数在组间进行比较(表2)，可以发现：①HBsAg阳性患者在化疗前CD3+、CD4+、CD8+细胞计数及CD4+/ CD8+比例与HBsAg阴性患者相比，差异无统计学意义(P＞0.05，图1)；②HBsAg阳性患者CD4+细胞计数化疗后均低于HBsAg阴性患者，以化疗后2～4个月时差异有统计学意义(P＜0.05，图1A)；③HBsAg阳性患者CD4+/CD8+比例低于HBsAg阴性患者，化疗后4～6个月起至化疗后12个月差异均有统计学意义(P＜0.05，图1C)；④化疗早期(2～4个月)时，HBsAg阳性患者CD3+细胞计数相比HBsAg阴性患者显著降低，差异有统计学意义(P＜0.05，图1D)。

表1 伴或不伴HBV感染的DLBCL患者基线情况比较Tab. 1 Comparison of the clinical characters between DLBCL patients with or without concurrent HBV infection

表2 伴或不伴有HBV感染的DLBCL患者化疗过程中外周血淋巴细胞亚群比较Tab. 2 Comparison of lymphocyte subgroups in peripheral blood in different stages of chemotherapy between DLBCL patients with or without concurrent HBV infection

图1 HBsAg阳性或阴性患者化疗过程阶段淋巴细胞亚群变化趋势Fig. 1 Trend of lymphocyte subgroups in peripheral blood in different stages of chemotherapy in DLBCL patients

3 讨 论

DLBCL是我国最常见的淋巴瘤病理亚型，我国DLBCL占淋巴瘤比例高达50%～60%，高于欧美国家报道的30%左右。国内外多宗回顾性研究显示，在DLBCL患者中，HBV感染率明显高于其他恶性肿瘤乃至淋巴造血系统恶性肿瘤，包括T细胞淋巴瘤及滤泡淋巴瘤等［1-5］。因此，HBV感染与DLBCL密切相关。前期研究证实HBsAg阳性的DLBCL患者在接受联合免疫化疗后，获得与HBsAg阴性患者类似的缓解率，但长期预后较差［6］。HBV慢性感染患者存在细胞免疫功能削弱，CD4+细胞减少，CD4+/CD8+比例降低［7-8］；但合并HBV感染对于DLBCL患者细胞免疫变化的影响目前鲜有报道。因此本研究对于这部分患者细胞免疫变化规律的描述，对进一步阐明HBV感染对于DLBCL患者预后影响的具体机制有重要意义。

本研究中，HBsAg阳性DLBCL患者与HBsAg阴性者的发病特征相比，在发病年龄、性别分布、淋巴瘤的分期、IPI分组及病理亚型差异均无统计学意义，提示HBV感染与否并未影响到淋巴瘤患者的肿瘤特性。另外，发病时HBsAg阳性患者的各主要T淋巴细胞亚群(CD3+、CD4+、CD8+细胞绝对计数)分布，以及CD4+/CD8+细胞比例与HBsAg阴性患者差异无统计学意义，提示HBV感染与否在发病初期并未对DLBCL患者的细胞免疫造成显著影响。HBV感染与DLBCL发病之间虽然存在密切联系，但本研究中也未发现HBV感染是直接造成DLBCL发病的相应证据。

然而，DLBCL患者在化疗后，HBsAg阳性患者CD4+细胞计数化疗后均低于HBsAg阴性患者，化疗后2～4个月时差异有统计学意义；而在化疗后HBsAg阳性DLBCL患者CD4+/CD8+比例低于HBsAg阴性患者，化疗后4～6个月起至化疗后12个月差异仍有统计学意义。提示合并HBV感染的DLBCL患者在化疗后出现的细胞免疫抑制，不仅程度更为严重，而且时间较为持久。

淋巴瘤发生、发展过程中，宿主的免疫因素具有很重要的作用；宿主免疫因素的削弱，使肿瘤监视减弱，最终可导致肿瘤复发进展［13］。结合本研究及前期研究结果可以推测，合并HBV感染对于DLBCL患者的肿瘤特性及发病初期的细胞免疫并无显著影响［6］，因此患者经过标准化疗后可以取得类似的缓解率；但由于HBsAg阳性患者存在治疗后较为严重而持续的细胞免疫抑制，宿主免疫系统对于肿瘤监视作用削弱，导致疾病复发进展增多，最终长期预后相对较差。

总之，合并HBV感染使DLBCL患者化疗后出现更为严重而持久的细胞免疫抑制，可能是导致其预后不良的重要因素；对这部分患者细胞免疫的监控及进一步深入研究，有望改变其不良预后。

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The impact of hepatitis B virus concurrent infection on peripheral T cells in diffuse large B cell lymphoma patients

WEI Zheng, CHENG Yun-feng, WANG Zhi-mei, ZOU Shan-hua
(Department of

Hematology, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China)

ZOU Shan-hua E-mail: zou.shanhua@zs-hospital.sh.cn

Background and purpose: The clinical relevance of HBV infection with respect to diffuse large B cell lymphoma(DLBCL) patients and immune patterns of T lymphocyte subsets during chemotherapy remains unclear. This study aimed to identify the characteristics of T-cell mediated immunity in DLBCL patients with HBV infection, thereafter, to explore the possible cell-mediated immune mechanisms of HBsAg positive HBV infection on the survival of DLBCL. Methods: A total of 294 newly diagnosed DLBCL patients were enrolled in this cohort study. Four-color flow cytometric method was used to enumerate the absolute number of CD3+, CD4+, CD8+T lymphocytes and theCD4+/CD8+ratio in peripheral blood samples, at the onset of disease, 2-4, 4-6 and 6-12 months after the initiation of chemotherapy, individually. Results: The absolute number of CD3+, CD4+, CD8+T lymphocytes in both groups were similar at the onset of disease; the count of CD4+lymphocytes was lower in HBsAg positive group during 2 to 4 months after the initiation of chemotherapy, compared with that in the HBsAg negative group. During 4 to 12 months after chemotherapy, the CD4+/CD8+ratio in peripheral blood samples was significantly lower in HBsAg positive group. Conclusion: For newly diagnosed DLBCL patients who received chemotherapy, the dynamic nature of cell mediated immune response was characterized as a low counts of CD4+T lymphocyte during the fi rst several cycles of chemotherapy followed by a decreased circulating CD4+/CD8+ratio. Depressions of cell immunity after chemotherapy in HBsAg positive DLBCL patients were greater and prolonged.

Diffuse large B cell lymphoma; Cell immunity; Chemotherapy

10.3969/j.issn.1007-3969.2014.10.009

R733

A

1007-3639(2014)10-0765-05

2014-07-15）

邹善华 E-mail:zou.shanhua@zs-hospital.sh.cn