益心解毒方对Ameroid缩窄环致气虚血瘀小型猪证候表征的影响*

仇 琪 王 勇 杨克旭 李 春 所 伟 啜文静 王 伟 林 阳△

(1.首都医科大学附属北京安贞医院临床药理中心，北京 100029;2.北京中医药大学，北京 100029)

冠心病心功能不全是冠状动脉粥样硬化性心脏病的严重阶段，是心肌长期慢性缺血致能量供应不足或能量代谢失衡时机体的综合表现[1]。气虚血瘀是冠心病心功能不全患者最常见的中医证候[2，3]。患者体征表现为神疲乏力、少气懒言、自汗、舌胖或有齿印、脉虚无力(弱、软、濡等)伴胸痛、舌质紫黯、或有瘀点瘀斑等，生活质量显著下降。大量临床研究表明，中药复方给药能够显著缓解患者气虚血瘀证表征[4，5]。本研究应用Ameroid缩窄环致小型猪心功能不全气虚血瘀证病证结合模型对益心解毒方改善气虚血瘀证表征疗效进行评价的同时，对该模型气虚血瘀证的诊断进行反证。

1 材料

1.1 动物

健康四川巴马小型猪22只，体质量20±2kg，月龄6～10个月，雌雄各半，购自中国农业大学清洁级实验动物饲养基地(许可证号SYXK(京)2011-0006)。

1.2 仪器

麻醉机(美国，North American Drager);CV-2000电脑高频电刀(中国，北京康威电子技术有限公司);FX-7202便携式心电图机(日本，福田电子株式会社);D100数码相机(日本，Nikon)。

1.3 药品及耗材

Ameroid缩窄环 (Ameroid constrictor)，内径2.75mm(Research Instrument SW，USA);安尔碘(上海利康消毒高科技有限公司，批号20050808);盐酸氯胺酮注射液(江苏恒瑞医药股份有限公司，批号KH050302);地西泮注射液(天津金辉氨基酸有限公司，批号0506131);地高辛(上海医药集团有限公司信谊制药总厂，批号100505);益心解毒方(由黄芪、丹参、银花等药材组成，所有药材均购于北京同仁堂制药有限公司，北京中医药大学中药学院以水提醇沉工艺进行加工)。

2 方法

2.1 造模方法

实验小型猪术前禁食24 h，适量饮水。肌肉注射氯胺酮25 mg·kg－1诱导麻醉，并建立耳缘静脉通路维持。模型组动物18只，于冠状动脉左前降支第一对角支上方，距心耳边缘0.5～1 cm处放置直径2.75 mm的Ameroid环[6]，关胸。另制作假手术动物4只，不放置Ameroid环，其他操作均与模型组一致。

2.2 分组及给药

所有动物于术后3周末行冠脉造影、宏观体征、超声心动及凝血相关指标检查。模型组根据左心室射血分数(EF)检查结果随机分为模型组6只，地高辛组6只(每日1次，每次0.0125 mg·kg－1，益心解毒方组6只(每日2次，每次1 g·kg－1)。于评价后次日(术后4周)开始给药，持续8周。

2.3 指标检测

2.3.1 宏观体征气虚血瘀证证候积分 于给药前、给药后第2、4、8周末对各组动物宏观表征进行观察，观察指标包括摆尾次数、精神状态、被毛、舌色、爪甲、鼻盘等。对各部位观察结果进行证候积分(满分10分)并用摄像机摄录，其中摆尾次数以1 min内摆尾次数计算，摄录3次共3 min，取平均值。

2.3.2 局部照片采集 于给药前后第2、4、8周末采集小型猪足底、鼻盘、舌面图像，图像采集过程以顶棚日光灯照明方式在室内完成，固定对光角度。将小型猪2/3常规剂量麻醉，拍照时保证比色卡与小型猪被观察部位处于同一平面。

2.3.3 图像分析 使用Adobe Photoshop 8.0.1软件对图像进行分析。首先，根据Casmatch比色卡说明将待分析图像进行归一化处理，再采用“直方图”工具，对图像选定区域内的R、G、B(即红、绿、蓝色度值)均值进行记录，输入Excel表格待统计分析[7]。

2.4 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计分析，数据结果以均数±标准差(s)表示。相同时间点各指标组间比较采用ANOVA方差分析法进行统计分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

观察时间窗内，模型动物宏观体征呈现精神紧张、易激惹、目光晦暗无神、皮毛疏松杂乱且少泽、单位时间内摆尾次数减少且尾部缩、行动缓慢、鼻盘干燥、趾蹼间肌肤甲错、舌青紫暗红、舌态欠灵活等特点。

3.1 心功能不全气虚血瘀证小型猪宏观体征血瘀证证候积分分析

表1显示，不同时间点各组动物宏观体征血瘀证证候积分结果显示，给药前心功能不全模型动物血瘀证积分与假手术组比较显著升高(P＜0.05或P＜0.01)。药物治疗后，各治疗组动物证候积分逐渐下降，至给药后8周，与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。

表1 不同时间点各组宏观体征血瘀证证候积分比较(s，min)

表1 不同时间点各组宏观体征血瘀证证候积分比较(s，min)

注:与假手术组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与模型组比较:△P＜0.05，△△P＜0.01

组 别 例数 给药前 给药后2周 给药后4周 给药后8周假手术组△△

3.2 心功能不全气虚血瘀证小型猪局部图像色度分析

3.2.1 各组间动物舌部图像色度分析 表2-1显示，给药后8周，益心解毒方组动物舌RGB、R、G、B值与模型组比较均显著降低(P＜0.01)。

3.2.2 各组间动物鼻部图像色度分析 表2-2显示，给药前，假手术组鼻部图像RGB、R、G、B值均显著高于模型动物(P＜0.01或P＜0.05);给药后4周及给药后8周，益心解毒方组RGB、R、G、B值与模型组比较均显著上升(P＜0.01或P＜0.05)。

3.2.3 各组间动物前蹄图像色度分析 表2-3显示，给药后4周，模型组前蹄RGB值、B值及地高辛组R、G值均显著高于假手术组(P＜0.01)，益心解毒方组 RGB、R、G、B值显著低于模型组(P＜0.01);给药后8周，模型组、地高辛组动物前蹄RGB、R、G、B 值显著高于假手术组(P ＜0.01)，益心解毒方组上述指标测定值显著低于模型组(P＜0.05)。

4 讨论

证候表征是中医诊断和治疗的核心，也是中药干预的对象。病证结合动物模型的建立和评价是目前中医药临床前研究过程中的热点和难点问题。望诊是实验动物表征采集的重要方式[8]。将患者的证候诊断指标与动物表征指标的病理意义进行比较后，对患者与动物模型进行证候属性同质性判定是目前被广泛接受的证候表征判断方式[9，10]。然而，评价方法的客观化和标准化一直是广大学者关注的重点。

表2-1 各时间点舌部色度组间比较 (s)

表2-1 各时间点舌部色度组间比较 (s)

注:与假手术组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与模型组比较:△P＜0.05，△△P＜0.01

组别 例数 给药前 给药后2周 给药后4周 给药后8周RGB 值假 手 术 组 4 115.28±18.04 106.91±12.05 106.16± 8.00 98.25±32.96模 型 组 6 127.76± 7.58 124.03± 8.88 121.50±11.22 151.33±13.50＊＊地 高 辛 组 6 120.53±25.17 112.93±25.71 116.19±13.59 129.99±19.73*益心解毒方组 6 130.33±14.93 113.22±24.12 109.50±15.53 88.08±26.74△△R值组假 手 术 组 4 142.91±17.56 131.81±11.25 134.04±12.97 124.14±38.80模 型 组 6 152.49±10.63 150.78± 8.87 147.60±13.76 181.92± 9.97＊＊地 高 辛 组 6 148.86±31.74 141.39±22.90 145.79±11.05 156.33±16.36益心解毒方组 6 155.83±16.45 142.58±23.23 132.29±16.20 106.31±33.35△△G值组假 手 术 组 4 99.96±14.88 94.43±15.25 95.24±10.04 85.66±30.76模 型 组 6 116.33±7.39 110.27±10.10 110.23±9.87 138.17±13.21地 高 辛 组 6 112.85±27.99 100.54±26.79 102.80±17.70 119.54±23.18益心解毒方组 6 119.43±14.78 102.19±25.21 98.82±16.34 80.62±25.28△△B值组假 手 术 组 4 100.49±20.34 92.49±10.79 92.69± 7.33 84.93±30.23模 型 组 6 114.46± 9.10 111.05± 9.14 106.67±11.00 133.89±18.32＊＊地 高 辛 组 6 110.50±27.05 96.87±28.23 101.01±15.64 111.90±20.90益心解毒方组 6 115.73±14.91 94.88±24.15 97.39±14.26 77.32±24.10△△

表2-2 各时间点鼻部色度组间比较 (s)

表2-2 各时间点鼻部色度组间比较 (s)

注:与假手术组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与模型组比较:△P＜0.05，△△P＜0.01

组别 例数 给药前 给药后2周 给药后4周 给药后8周RGB 值 组假 手 术 组 4 147.98± 8.86 148.53± 5.14 139.68±10.07 149.63±22.76模 型 组 6 127.20± 2.90＊＊ 133.36± 5.43* 120.32±14.13* 117.84±12.78＊＊地 高 辛 组 6 120.59± 6.24＊＊ 129.00±5.02＊＊ 117.82± 6.20* 126.87± 4.46*益心解毒方组 6 132.66± 6.71* 132.67± 8.02* 137.69± 7.71△ 145.59±12.70△△R值组假 手 术 组 4 178.12±3.02 176.49±8.43 170.99±3.23 185.73±21.42模 型 组 6 152.80±15.26＊＊ 163.86± 9.24 147.51±17.78* 149.95±16.95＊＊地 高 辛 组 6 151.71±10.35＊＊ 161.09±9.72 152.50±6.96* 156.04±5.44*益心解毒方组 6 161.02± 6.72* 159.28±6.57 165.45± 7.23△ 174.62±12.43△G值组假 手 术 组 4 135.99±11.59 131.70± 4.22 130.09±18.63 135.77±21.26模 型 组 6 119.00± 6.27 124.26±10.30 111.41±15.15 106.04±13.48＊＊地 高 辛 组 6 109.23±7.22＊＊ 119.09±8.44 104.43±8.47* 115.21±11.29益心解毒方组 6 124.17±10.64 124.69±11.53 130.24± 7.50△ 136.63±12.04△△B值组假 手 术 组 4 129.84±11.98 127.40± 8.35 117.95±10.28 127.40±25.67模 型 组 6 109.80± 2.94* 111.95±10.17* 102.04±10.09 97.52±10.39＊＊地 高 辛 组 6 100.82± 7.38＊＊ 106.82±7.97＊＊ 96.51± 5.09* 109.35± 6.88益心解毒方组 6 112.81± 6.53* 114.03±12.01 117.37±10.98△ 125.52±14.28△△

课题组在前期研究中，根据1986年《血瘀证诊断标准》与1986年5月修订的《中医虚证辨证参考标准》，通过 casmatch标准比色卡校准，采用Photoshop软件将动物局部色质转化为R、G、B值进行定量分析;小型猪的活动度、乏力懒动等症状结合中兽医学经验，以摇尾实验进行分析;结合一般状况如毛发、精神状况及挣扎力度等运用中医基础理论进行辨证，确定模型动物的基本证候，认为Ameroid缩窄环致心肌缺血小型猪术后4～12周具备气虚血瘀证指征[11]。笔者针对大鼠血瘀证前期研究结果显示，模型动物舌色、足底、耳廓的图像色度改变与血液流变学指标改变呈显著相关[12]。结合上述研究结果，本实验选择术后第4周初作为给药起始时间点，以地高辛为对照药物，于给药前、后第2、4、8周对各组动物宏观体征进行动态监测，以观察药物对模型动物气虚血瘀证表征的改善作用。

表2-3 各时间点前蹄色度组间比较 (s)

表2-3 各时间点前蹄色度组间比较 (s)

注:与假手术组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与模型组比较:△P＜0.05，△△P＜0.01

组别 例数 给药前 给药后2周 给药后4周 给药后8周RGB 值 组假 手 术 组 4 155.54±13.56 147.92±11.75 141.87±113.91 128.12±11.54模 型 组 6 157.52±13.17 163.80±15.28 165.97± 10.95＊＊ 155.85±10.42＊＊地 高 辛 组 6 148.84±11.41 153.20±12.43 159.72± 10.85 157.46±16.84＊＊益心解毒方组 6 151.53±17.63 153.39±23.34 138.98± 12.06△△ 136.16±11.56△R值组假 手 术 组 4 188.00±8.47 183.24±4.84 176.77±14.43 166.75±11.51模 型 组 6 192.56±12.00 198.25± 9.94 197.45± 9.58* 193.14±14.00＊＊地 高 辛 组 6 189.91± 8.05 185.89± 9.26 196.60± 10.68* 193.23±10.28＊＊益心解毒方组 6 187.11±16.28 188.20±21.16 173.82± 9.04△△ 178.93± 5.17△△G值组假 手 术 组 4 148.06±14.78 136.88±14.53 134.93± 12.33 122.39± 7.64模 型 组 6 152.25±14.40 158.20±19.29 159.92± 13.25* 144.43±11.62*地 高 辛 组 6 138.42±11.75 147.47±14.94 154.68± 13.04 150.20±19.10*益心解毒方组 6 144.53±20.25 147.38±26.83 131.31± 14.77△△ 128.25±16.27 B值组假 手 术 组 4 130.55±17.52 118.65±15.00 113.92± 15.11 95.23±18.78模 型 组 6 127.76±14.48 134.95±19.02 140.53± 13.61* 129.08± 9.83＊＊地 高 辛 组 6 118.18±14.95 126.25±14.72 127.76± 11.93 128.93±21.91＊＊益心解毒方组 6 122.97±17.20 124.59±22.57 111.82± 14.51△△ 101.31±13.75△△

心气虚衰导致心血瘀滞、炼聚成毒犯心，心脉不通、胸阳不振是冠心病心功能不全中医病机之根本。益心解毒方以益气温阳、活血解“毒”立法，由黄芪、丹参、银花等药物组成，主要针对冠心病心功能不全气虚血瘀证的治疗[13]。结果显示，地高辛给药8周后动物证候积分与模型动物比较显著改善，与地高辛改善心功能疗效相关，但该药物对动物局部图像色度无显著改善。益心解毒方能够改善模型动物宏观体征，降低证候积分，同时改善局部图像色度，减轻血瘀症状。此项结果进一步证实了模型动物体表局部色度改变可以作为证候的评价指标，而气虚血瘀对证治疗的效果显著亦对Ameriod缩窄环致小型猪心功能不全气虚血瘀证的存在进行了反证。

[1]卢建敏，孙琳，吴彧，等.参麦注射液联合左卡尼汀治疗老年缺血性心肌病心力衰竭疗效观察[J].中国全科医学，2008，11(14):1287-1288.

[2]张鹏，赵慧辉，陈婵，等.慢性心力衰竭常见证候和证候要素的现代文献研究[J].中华中医药杂志，2011，26(10):2378-2381.

[3]李莉，崔向宁.151例慢性心力衰竭血瘀证患者的证、治规律的回顾性分析[J].中国实验方剂学杂志，2012，18(18):268-271.

[4]郭书文，杨蟠储，郑承龙，等.益气活血中药联合常规西药治疗冠心病心肌缺血气虚血瘀证临床研究[J].中国中医药信息杂志，2012，19(9):15-17.

[5]谢东霞，毛秉豫.芪参益气滴丸对心肌梗死后气虚血瘀证患者心室重构及心功能的影响[J].中国实验方剂学杂志，2011，17(1):192-195.

[6]林阳，仇琪，杨克旭，等.益心解毒方对Ameroid缩窄环致心功能不全小型猪血液流变学的影响[J].北京中医药大学学报，2012，35(2):112-116.

[7]仇琪，李春，王勇，等.心肌缺血模型大鼠血瘀证相关信息的评价[J].中国中西医结合杂志，2010，30(09):974-977.

[8]赵慧辉，郭书文，王伟.病证结合动物模型判定标准的建立[J].北京中医药大学学报，2009，32(6):365-367，373.

[9]赵慧辉，王伟.病证结合证候模型研究基本思路[J].中华中医药杂志，2006，21(12):762-764.

[10]方肇勤，潘志强，陈晓，等.实验小鼠四诊方法学的创建和意义[J].上海中医药杂志，2006，40(7):1-4，F0003.

[11]王勇，李春，啜文静，等.基于小型猪冠心病慢性心肌缺血模型气虚血瘀证的证候评价[J].中国中西医结合杂志，2011，31(2):233-237.

[12]仇琪，李春，王勇，等.心肌缺血模型大鼠血瘀证相关信息的评价[J].中国中西医结合杂志，2010，30(9):974-977.

[13]李春，王勇，欧阳雨林，等.益心解毒方改善心梗后心衰大鼠心功能的作用研究[J].中国实验方剂学杂志，2012，18(13):165-168.