酶催化动力学光度法测定铜(Ⅱ)

柳畅先，朱苗苗，王 艺

(中南民族大学 化学与材料科学学院，武汉 430074)

铜是人体内的微量元素之一，但过量摄入会产生危害，铜对水生生物有较大影响.铜的毒性与其形态有关，游离Cu2+的毒性大于络合铜，故Cu2+含量是食品试样和水质监测的重要指标.近30年来酶反应动力学和酶催化作用的应用研究很活跃[1-3]，酶法可测定在酶促反应中作为底物、辅酶、激活剂和抑制剂而存在的物质.如Chen等[4]研究了抑制剂对血管紧张素转换酶的影响，用可见分光光度法和液相色谱法测定抑制剂并比较了这两种方法；Li等[5]将醇脱氢酶固定在毛细管中，用荧光法考察辅酶的变化以测定酒精含量，检测限1.1 g/L，变异系数为1.9%；Cheng等[6]用修饰酶电极检测废水中的葡萄糖，仅用不到5s的响应时间，有良好的灵敏度和准确性.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

分光光度计(721型，上海第三分析仪器厂)，精密pH计(PHS-3C型，上海雷磁仪器厂)，分析天平(FA-2004型，上海精科天平厂)，磁力搅拌器(78-1型，金壇市科兴仪器厂).

铜(Ⅱ)标准溶液(10.0 mmol/L)：称取0.125 g CuSO4·5H2O于烧杯中，加水溶解后定容至50 mL.尿素标准溶液(1.50 mol/L)，脲酶(0.8 U/L)，磷酸盐缓冲溶液(0.25 mol/L, pH=6.8).纳氏试剂[7]：称取8 g氢氧化钠溶于25 mL蒸馏水，冷却到室温；另称取5 g碘化汞和3.5 g碘化钾溶于15 mL水；将该溶液缓缓注入上述溶液中，加水至50 mL，搅拌，密塞保存.

1.2 实验方法

于Ep管中加入200 μL 0.25 mol/L 磷酸盐缓冲液(pH=6.8)，200 μL 1.50 mol/L尿素标准溶液，一定量的铜(Ⅱ)标准溶液，40 μL 0.8 U/L脲酶液后混匀，反应2 min，加入100 μL 3 mol/L硫酸溶液后混匀，移至10 mL比色管，用水稀释至刻度，加入1 mL纳氏试剂，测定425 nm处吸光度变化值(尿素水解产物与纳氏试剂反应生成红色氨络合物[7]，在425 nm处有最大吸收)，计算酶促反应速度.

v=△A×V/(△t×ε×b)，

式中v为酶促反应速度(酶活力，μmol/min),△A为吸光度变化值,V为比色管中溶液总体积(mL),△t为反应时间(min)，ε为摩尔吸光系数(L/cm·mmol),b为比色皿厚度(cm).相对酶活力=(酶活力/酶活力最大值)×100%.

根据米氏方程可求出抑制剂含量：

1/v=kc+a，

式中v为酶促反应速度(μmol/min),c为抑制剂浓度(μmol/L),k和a为常数.

2 结果与讨论

2.1 测定波长的影响

在390～480 nm内测定酶催化反应产物的吸收光谱，结果发现最大吸收波长为425 nm(见图1)，若无其它杂质吸收峰的干扰，选择425 nm作为测定波长.

λ/nm图1 波长对吸光度的影响Fig.1 The effect of the wavelength on the absorbance

2.2 反应溶液pH和温度的影响

在pH 6～8内测定了溶液pH值的影响(见图2a)，pH为6.8时酶促反应速度最大，推测这时酶处于最佳的空间构象和解离状态.温度对酶活性有显著影响(见图2b)，温度升高时，有更多的分子成为活化分子，使酶的活力增大，故酶促反应速度增大.但温度过高时，由于酶蛋白的热变性致使酶逐渐丧失活力，反应速度下降.按实验方法在0～80℃范围内测定了温度对酶促反应速度的影响，最适温度为60℃.

(a) pH值；(b) 温度图2 反应溶液pH和温度对酶活力的影响Fig.2 The effect of pH and temperation of reacting solution on the enzyme activity

2.3 底物浓度的影响

测定酶促反应中作为抑制剂存在的物质含量，保证高灵敏度的前提是无抑制剂存在时酶促反应速度尽可能大.考察了底物尿素浓度的影响(见图3)，尿素浓度增加到25 mmol/L以后，酶促反应速度达最大值并基本保持不变.

图3 尿素浓度对酶活力的影响 Fig.3 The effect of concentration of urea on the enzyme activity

2.4 共存组分的影响

试验了常见金属离子K+,Na+,Ca2+,Mg2+,Zn2+,Cd2+,Ni2+,Pb2+对测定的影响，发现Ca2+,Mg2+,Zn2+,Cd2+,Ni2+,Pb2+也对酶促反应速度有抑制，但比铜(Ⅱ)的抑制作用要小得多，以0.3 μmol/L铜(Ⅱ)进行干扰试验，相对误差在±5%之内时，共存组分允许量为：Zn2+(380倍)，Ca2+(300倍)，Mg2+(190倍)，Ni2+(190倍)，Cd2+(90倍)，Pb2+(70倍).

2.5 抑制剂标准曲线

按实验方法测定系列铜(Ⅱ)标准溶液的酶促反应速度，标准曲线见图4，回归方程为：1/v= 0.716+7.66c，R=0.9986，线性范围：0.09～20 μmol/L，检出限为0.05μmol/L.

图4 铜(Ⅱ)标准曲线Fig.4 The standard curve of Cu(Ⅱ)

2.6 试样测定

平行5次测定了模拟样(基体为湖水)中Cu2+含量，并进行加标回收，由表1可见，结果的精密度(RSD<5%)和准确度(回收率在95%～105%之间)较好.

表1 试样测定及加标回收结果(n=5)

参 考 文 献

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