MMP3 基因启动子rs102715950(5A/6A)单核苷酸多态性与河南人群食管鳞癌易感性的关系

李 劲, 李可可，姚品芳，陈静波，陈 真

(1 中南民族大学 生命科学学院，武汉 430074；2 湖北省肿瘤医院, 武汉 430079)

食管癌(esophagus cancer)是最常见的消化系统肿瘤之一，我国是世界上食管癌发病率和死亡率最高的国家，每年约新诊断25万食管癌病例，占世界食管癌病例数1/2，严重危害我国人民的健康和生命[1,2].基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases, MMPs)是一类结构相似、高度保守、依赖锌离子的肽链内切酶家族，目前已分离出26个成员，分别为MMP1～26.它是肿瘤浸润转移过程中最重要的调控分子之一，现已在多种人类肿瘤中检测到，且与肿瘤浸润转移力呈正相关[3,4]， MMPs家族与肿瘤遗传易感性研究成为肿瘤的预防、早期诊断和治疗的分子生物学理论基础[5].

rs102715950(5A/6A)位于MMP3基因5′端转录调控区，为该区域常见的DNA序列多态性，即位于转录起始点上游1612 bp处含有5个或6个腺苷酸(A)的等位基因.近年来已发现人类MMP3基因转录调控区-1612 5A/6A单核苷酸多态性与急性冠脉综合症、高血压伴颈动脉粥样硬化、出血性脑卒等疾病的发病明显相关[6,8].

本文利用PCR-RFLP对3类河南人群的MMP3基因进行分型，经Logistic 回归统计分析，探究MMP3基因-1612处DNA序列5A/6A单核苷酸多态性与河南人群食管癌易感性的关系.

1 材料与方法

1.1 材料

湖北省钟祥的河南淅川移民人群的EDTA抗凝静脉血，由湖北省肿瘤医院收集，并经胃镜检查和病理活检证实来自非食管癌患者；河南高发区(安阳)食管癌患者与当地正常对照人群的EDTA抗凝静脉血，由郑州大学基础医学院癌症研究室提供；所有标本均于-70℃冰箱保存.

依据血样样本来源和病理诊断分为3类人群，即河南食管癌患者人群，河南正常人群和湖北的河南移民人群.

1.2 方法

1.2.1 血样样本DNA的提取

采用蛋白酶K细胞裂解法提取样本DNA，于-20℃保存.

1.2.2 引物设计及酶切位点的筛选

利用Primer premier 5.0设计嵌套PCR引物和酶切位点的选择.引物设计：一次PCR引物Out-S: 5′-TAGGCTGAGCAAACTGCCACGC-3′，Out-A: 5′-TCCTGGGACTTGGGAAACAT-3′，扩增长度2120 bp，Tm=65.5℃.二次PCR引物5A/6A-S:5′-TTCTCCATTCCTTTGATGGGGGGAAAGACC-3′， 5A/6A-A: 5′-CCACCACTCTGTTCTCCTTGTCCTCATA-3′，扩增长度105 bp，Tm=57℃.限制性内切酶选择Tth111 I，SNP位点rs102715950 (5A/6A)，酶切温度65℃，酶切后片段长度79，26 bp.

1.2.3 反应体系和循环

参照taq酶的使用说明书配制体系.一次PCR：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，65.5℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环，72℃延伸5 min.二次PCR：94℃ 预变性5 min，94℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环，72℃延伸5 min.按照Tth111 I限制性内切酶的说明书配制酶切反应体系，酶切结果通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和EB染色进行检测.

1.2.4 统计学处理

将各人群基因组基因型分布进行Hardy-Weinberg平衡检验.将各个基因组涉及年龄、性别、基因型等信息导入SPSS 19.0软件，进行多因素Logistic回归统计分析.

2 结果

2.1 PCR-RFLP法对rs102715950 (5A/6A)SNP基因多态性分析结果

2.1.1 巢式PCR产物的凝胶电泳检测

经巢式PCR扩增得到105 bp的DNA片段(见图1)，DNA带型整齐亮度清晰，无明显非特异杂带，表示PCR扩增效果良好，产物特异性高.

图1 PCR产物琼脂糖凝胶电泳图Fig.1 Agarose electrophoretogram of PCR product

2.1.2 DNA酶切分型结果

PCR扩增的片段经Tth111 I限制性内切酶酶切，聚丙烯酰胺凝胶电泳(12%)检测，其结果见图2.由图2可见泳道1为基因组杂合型(DNA半数酶切)，即5A/6A基因型，酶切片段分别为105，79，26 bp；泳道2是基因组纯合型(DNA完全不酶切)，即6A/6A基因，只有105 bp片段；泳道3为基因组纯合型(DNA完全酶切)，即5A/5A基因型，酶切片段为79，26 bp.

图2 Tth111I酶切PCR产物结果Fig.2 Tth111I enzyme PCR products results

2.2 统计分析结果

2.2.1 不同人群MMP3基因rs102715950 (5A/6A)位点的基因频率

不同人群MMP3基因rs102715950 (5A/6A)位点的基因频率结果见表1.由表1可见,5A︰6A代表各类人群的5A型和6A 型的比例.5A、5A/6A、6A代表各类人群在相对应的基因型的例数和所占的比率.其中Hardy-Weinberg平衡值均大于0.05，说明取样具有代表性.

表1 不同人群MMP3基因rs102715950 (5A/6A)SNP位点的基因频率Tab.1 Genotype frequency of MMP3 rs102715950 (5A/6A) of different groups

2.2.2 多因素Logistic回归分析

河南3类人群不同基因型的比较结果见表2.由表2可见，河南食管癌人群和河南高发移民人群、河南食管癌人群和河南正常人群、河南高发移民人群和河南正常人群在5A5A︰5A6A、5A5A︰6A6A、5A6A︰6A6A、5A5A︰非5A5A、6A6A︰非6A6A6种基因型比较结果均为p>0.05.

表2 3种河南人群之间不同基因型的相互比较

注：因河南移民人群和河南正常人群中均无6A6A基因型，故两个人群在该基因型的对比上无数据，用-代表

3 讨论

太行山区，特别是河南人群是我国食管癌的高发人群，当地多年的流行病学调查发现：食管癌呈明显的人群和家族聚集现象，暗示该疾病的潜在遗传性影响和特点，故探究食管癌河南高发区人群基因组中食管癌相关基因的SNP多态性对人群食管癌遗传易感的关联性具有重要意义.鉴别与肿瘤发生发展相关的基因变异，为癌症的预防、临床诊断和治疗等提供分子标记，对疾病的预防和诊断具有重要意义，并将改善和提高中国人群食管癌的预防、筛查、早期诊断和个体化治疗的工作水平[9].

MMP3属于MMPs家族中基质溶解素类的一种，MMP3基因转录调控区多态性以等位基因的差异化方式调节MMP3的转录活性[10-12].本研究涉及的MMP3基因5′端转录调控区多态性于1995年首次由ye等[13]报道.迄今发现该区域共有6个多态性位点.本研究的对象rs102715950 (5A/6A) SNP位于MMP3基因的转录调控区内，为该区域常见的多态性位点.马岩萍等[14]报道5A/6A基因多态性与汉族原发性高血压(essential hyper tension, EH)伴颈动脉粥样硬化(carotid ather osclerosis, CAS)具有相关性，6A 等位基因可能增加了EH 患者伴发CAS 的风险.何春燕等[15]发现MMP3基因5A/6A 多态性与急性冠脉综合征危险性有关，并在冠心病的发生发展中起重要作用.Humphries等[16]证实了MMP3基因5A/6A多态性和吸烟相互作用与男性冠心病具有相关性.Krippl等[17]发现MMP3基因5A/6A多态性与乳腺癌易感性不相关，但提高了乳腺癌患者的转移风险.

张等[18]针对243例食管鳞癌患者进行基因组MMP3基因的SNP分型，结果证明rs102715950 (5A/6A)单核苷酸多态性与食管鳞癌的发展和淋巴转移相关 .本文针对河南安阳地区的食管鳞癌散发患者、当地健康人群、湖北钟祥的河南淅川移民3类人群共381份血液样本进行基因组MMP3基因的SNP分型，探究MMP3基因rs102715950 (5A/6A)单核苷酸多态性与河南食管癌易感性的关系.结果表明：河南食管癌人群与河南移民人群、河南食管癌人群与河南正常人群、河南移民人群与河南正常人群在5A5A︰5A6A、5A5A︰6A6A、5A6A︰6A6A、5A5A︰非5A5A、6A6A︰非6A6A的6种基因型比对中均无显著性差异(p>0.05).这提示MMP3基因的rs102715950 (5A/6A)单核苷酸多态性与河南人群的食管癌易感性不具明显的相关性.本研究还需要更多的样本进行更细致深入的鉴别.如还需要在大样本量条件下，对该基因上的其他诸多SNPs(基因表达调控区和编码区的SNPs)的多性和相关SNPs的人群单倍型不同构成方面等，与食管癌遗传易感性的相关性进行更多的研究和探讨.

参 考 文 献

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