马铃薯炭疽病(Colletotrichumcoccodes)拮抗菌株的筛选及鉴定

王涵琦，畅 涛，杨成德，陈秀蓉

(甘肃农业大学草业学院,草业生态系统教育部重点实验室,甘肃省草业工程实验室,中-美草地畜牧业可持续发展研究中心，兰州 730070)

马铃薯炭疽病(Colletotrichumcoccodes)拮抗菌株的筛选及鉴定

王涵琦，畅 涛，杨成德*，陈秀蓉

(甘肃农业大学草业学院,草业生态系统教育部重点实验室,甘肃省草业工程实验室,中-美草地畜牧业可持续发展研究中心，兰州 730070)

采用对峙培养法对马铃薯炭疽病的拮抗菌株进行了筛选和鉴定。结果表明，拮抗菌株ZHA10对炭疽病病原菌具有良好的抑制作用，抑制率达76.43%，其可以使病原菌菌丝变形和裂解；ZHA10菌体短杆状、革兰氏阳性、大小为(0.5～0.75)μm × (1.5 ～3.1)μm、芽胞中至尖端生。通过生理生化测定、16S rDNA以及gyrB序列分析，鉴定ZHA10为枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)。此外，ZHA10还对番茄早疫病菌(Alternariasolani)、马铃薯干腐病菌(Fusariumoxysporum)、孜然根腐病菌(Fusariumsolani)、小麦根腐病菌(Bipolarissorokiniana)、黄瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum)和马铃薯褐腐病菌(Stysanusstemonitis)均具有较强的拮抗作用。ZHA10抑菌能力良好，抑菌谱宽，具有进一步开发应用的潜力。

炭疽病； 生防菌株； 筛选； 鉴定

生物防治(biological control)是指利用有益生物及其生物代谢产物对植物病害进行有效防治，从而为生产者、消费者和环境降低风险，提高利益[1]。目前，用于植物病害生物防治的生防因子主要有真菌、细菌、放线菌和病毒等。研究报道，生防真菌木霉已用于防治花生立枯病菌、水稻纹枯病菌、水稻恶苗病菌、辣椒炭疽病菌、白术白绢病菌等多种植物病害以及蔬菜根腐病等土传病害[2]。 生防细菌则主要有芽胞杆菌(Bacillus)[3]、假单胞杆菌(Pseudomonas)、土壤放射杆菌[Agrobacteriumradiobacter(Beijerinck and van Delden) Conn][4-5]等。以芽胞杆菌开发的Companio、HiStickN/TKo-diak和Serenade,以假单胞菌开发的BioJect Spot-Less、Bio-save、BlightBan和Cedomon,以放射性农杆菌开发的Galltrol和Nogall可控制多种植物病害[6]。马铃薯炭疽病由半知菌亚门炭疽菌属的球炭疽菌引起，病菌抗逆能力强，存活时间较长[7]。该病是近年甘肃省马铃薯种植区的一种主要病害，能够侵染马铃薯的各个部位，严重影响其产量和品质[8]。有关马铃薯炭疽病生物防治的方法未见文献报道，故本试验拟从高寒草地牧草内生菌中筛选出对马铃薯炭疽病具有良好防效的生防细菌并鉴定，以期为马铃薯炭疽病的生物防治提供菌种资源和理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

指示菌：马铃薯炭疽病菌[Colletotrichumcoccodes(Wallr.)Hughes]、马铃薯干腐病菌[Fusariumoxysporum(Mart.)Sacc.]、黄瓜枯萎病菌 (Fusariumoxysporumf.sp.cucumerinumOwen)、孜然根腐病菌[Fusariumsolani(Mart.)Sacc.]、马铃薯褐腐病菌[Stysanusstemonitis(Smith) Smith]、小麦根腐病菌[Bipolarissorokiniana(Sacc.)Subram.Gain.]、番茄早疫病菌[Alternariasolani(EllisetMartin) JonesetGrout]，均由甘肃农业大学草业学院植物病理实验室提供。

供试拮抗菌株：土壤细菌B1和B2；401、ZHA10、ZA1、TY、XA7、ZHA4、T4、ZB2、ZHC11、ZHA9、ZA14和402等从149株高寒草地牧草内生细菌中初筛出的拮抗菌株，均由甘肃农业大学草业学院微生物多样性实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 拮抗菌株的筛选

将供试菌株与指示菌分别接于牛肉胨、PDA平板上活化后，用打孔器打成直径为6 mm的菌饼。取指示菌一块置于平板中央，在距中央3 cm的圆周上等距离接4块供试菌株(即对峙法)，重复3次，后置于28 ℃下培养，对照满皿后，十字法测量菌落直径，重复3次，计算抑制率。并分别挑取处理组和对照组病原菌菌落边缘的菌丝体，制片，在显微镜下观察菌丝形态的变化并拍照。

抑制率(%)=(对照组菌落直径-处理组菌落直径)/(对照组菌落直径-原菌饼直径)×100。

1.2.2 抑菌谱测定

采用对峙培养法，测定拮抗菌对几种病原菌的抑菌能力，方法同1.2.1。

1.2.3 生防菌株的生理生化鉴定

1.2.3.1培养性状和形态特征

拮抗菌活化后分别接种于NA斜面、平板及NB培养液，于28 ℃下培养5 d后观察培养性状。将拮抗菌在牛肉胨平板上活化培养18～24 h后进行革兰氏染色和芽胞染色[9]，观察菌体和测量菌体的长度及宽度(30个)，并显微拍照。

1.2.3.2生理生化测定

具体方法参照《常见系统细菌鉴定手册》[10]和《伯杰细菌鉴定手册》[11]进行。

1.2.3.316S rDNA序列分析

按上海生工提供的试剂盒(Ezup柱式基因组DNA抽提试剂盒)提取DNA并检测，对具有特异性DNA条带样品进行PCR扩增。

使用引物1(5′-CCGGATCCAGAGTTTGATCATGGCTCAGCA-3′)和引物2(5′-CGGGATCCT ACGGCTA CCTTGTTACGACTT-3′)进行PCR扩增，扩增条件为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性10 s，54 ℃退火20 s，68 ℃延伸40 s，35个循环；最后在68 ℃下延伸7 min，终止反应。反应体系：10×buffer(含MgCl2)5 μL，dNTP (2.5 mmol/L)1 μL。primer 1(10 μmol/L)1 μL，primer 2 (10 μmol/L)1 μL，Taq poly-merse (2 U/μL)0.4 μL, Target DNA (10 ng/μL)1 μL，ddH2O 40.6 μL，总体积为50 μL。经检测，将具特异性条带的扩增产物送上海生工公司测序，所测序列与GenBank数据库中已报道的序列进行相似性比较(http:∥www.ncbi.nlm.nihgov/blast.cgi)，并采用Clustal(1.8)软件进行多重序列比较，再用Mega(4.0)软件中的邻接法构建系统发育树[13]，确定拮抗菌的系统发育学地位。

1.2.3.4gyrB基因序列系统发育分析

gyrB基因序列分析使用引物UP-1(5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCATGCCGGTG-GAAAGTTCGA-3′)和引物UP-2(5′-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCATCTACGTCAGCGTC-AGTCAT-3′)进行扩增[21]。扩增体系：10×PCR buffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl22 μL，25 mmol/L dNTP 1 μL，Taq酶 1 μL，UP-1 1 μL，UP-2 1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 15.5 μL，总体系25 μL。扩增条件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30个循环；72 ℃10 min；4 ℃保持1 h。其他方法同1.2.3.3。

2 结果与分析

2.1 拮抗菌株的筛选

结果表明，菌株TY和ZA14等菌株与炭疽菌重叠生长，无拮抗作用；ZHA4和402菌株与炭疽菌之间没有明显的界线，但菌落内炭疽菌不能生长，营养竞争作用明显；B1、B2、T4、401、ZA1、XA7、ZHA10、ZHC11、ZB2和ZHA9菌落周围有明显的抑菌圈，抑菌作用明显，且抑制率均在70%以上，B1、B2和ZHA10对马铃薯炭疽病菌抑制率均在76%以上(表1)。ZHA10为高寒草地牧草内生细菌，其可能具有较强的耐低温性，有利于马铃薯窖藏期低温时期应用，因此本试验选用高寒草地内生细菌ZHA10为研究对象进行以下试验。

表1供试强拮抗菌株对马铃薯炭疽病菌的抑制效果

Table1TheinhibitionofColletotrichumcoccodesbytheantagonists

拮抗菌Antagonisticbacterium菌落直径/cmDiameterofcolony抑制率/%InhibitionrateB22．32±0．00176．43bT42．59±0．01272．85de4012．54±0．00573．57cdeZA12．43±0．00275．00bcXA72．65±0．02472．14eB12．10±0．00279．29aZHA102．32±0．00576．43bZHC112．48±0．06074．29cdZB22．87±0．00569．29fCK8．21±0．013-

图1 B1、B2和ZHA10对炭疽菌的拮抗作用Fig.1 Antagonistic reaction of the strains B1,B2 and ZHA10 against Colletotrichum coccodes

用ZHA10处理马铃薯炭疽菌后，炭疽菌菌丝生长形态异常，出现膨大、扭曲现象，菌丝内的原生质发生凝集，菌丝顶端和中部出现泡状物，菌丝的泡状物破裂，原生质外溢。对照菌丝光滑，均匀(图2)。

2.2 抑菌谱测定

在测试的7种病原真菌中，ZHA10对马铃薯炭疽病菌、马铃薯干腐病菌和番茄早疫病菌的抑制效果良好，抑制率分别是72.62%、72.28%和70.38%；对孜然根腐病菌、小麦根腐病菌、黄瓜枯萎病菌和马铃薯褐腐病菌的抑制效果次之，但也在60%以上(表2)。说明ZHA10对马铃薯的多种病原菌有很好的抑制作用。其抑菌谱宽，在马铃薯病害生物防治中潜力大。

表2ZHA10对其他病原真菌的抑制作用

Table2AntagonisticspectrumofZHA10againstpathogens

供试病原菌Pathogenicfungus菌落直径/cmDiameterofcolony对照/cmCK抑制率/%Inhibitionrate孜然根腐病菌Fusariumsolani2．957．4565．45小麦根腐病菌Bipolarissorokiniana3．357．7761．63黄瓜枯萎病菌Fusariumoxysporumf．sp．cucumerinum3．508．0761．16番茄早疫病菌Alternariasolani2．557．1870．38马铃薯干腐病菌Fusariumoxysporum2．688．1272．28马铃薯褐腐病菌Stysanusstemonitis2．336．2563．30马铃薯炭疽病菌Colletotrichumcoccodes2．316．8372．62

2.3 拮抗菌株的鉴定

2.3.1 形态特征

拮抗菌株ZHA10为革兰氏阳性，短杆状(图3左)，芽胞中至尖端生(图3右)，菌体大小为(0.5～0.75)μm×(1.5～3.1)μm。在NA平板上，菌落扁平，大小为0.5 cm，呈不规则状，边缘裂片状，颜色乳白色，边缘乳黄色。有黏性，质软，菌落不透明。

图3 ZHA10革兰氏染色(左)和芽胞染色(右)(20×100)Fig.3 Gram staining (left) and spore staining (right) of ZHA10

2.3.2 生理生化特征

生理生化结果表明，ZHA10菌株在厌氧条件下可以生长；最高生长温度为40 ℃，最低生长温度为15 ℃，最适宜生长温度为25～30 ℃；可以在pH6.8和pH5.7的营养肉汤中生长；能够利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和甘露醇产酸；可以使明胶液化；能水解淀粉和还原硝酸盐；不能利用丙二酸盐；V-P测定为阳性；具有耐盐性,可以在10% 的NaCl培养基中生长；接触酶、酪朊水解呈阳性, 苯丙氨酸脱氨酶、酪胺酸水解均呈阴性。经与《常见细菌系统鉴定手册》对照，上述特征均符合芽胞杆菌生理生化特征，初步鉴定ZHA10为芽胞杆菌。

2.3.3 16S rDNA序列分析与系统发育树的构建

菌株ZHA10的序列长度为 1 451个碱基序列。经Blast相似性分析，菌株ZHA10与多株芽胞杆菌属菌株相似度均达到99%以上，用MEGA version 4.0将菌株ZHA10与来自 GenBank的5株不同种芽胞杆菌一起构建基于 16S rDNA 序列的系统发育树(图 4)，结果显示，ZHA10与枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)GQ861467、芽胞杆菌(Bacillussp.)EU442608聚在一起，说明ZHA10与枯草芽胞杆菌遗传距离更近，结合生理生化结果初步鉴定ZHA10为枯草芽胞杆菌。

图4 基于16S rDNA 序列构建的ZHA10 系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence of strain ZHA10

2.3.4 gyrB序列分析与系统发育树的构建

对菌株ZHA10的gyrB序列进行PCR扩增，产物经纯化后测序，得到的片段长度为1 000个碱基序列。用BLAST软件经相似性比较，结果表明ZHA10与已报道的Bacillussubtilis(JX282194)和Bacillussubtilis(JQ653052)等菌株的相似性在99%以上。用Mega(4.0)软件构建系统发育树，ZHA10与Bacillussubtilis(JX282194)最近(图5)。菌株ZHA10的形态学、生理生化反应特征与枯草芽胞杆菌一致，结合基于 16S rDNA 序列和gyrB序列的系统发育树分析结果，将菌株ZHA10鉴定为枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)。

图5 ZHA10的gyrB系统发育树Fig.5 Phylogenetic tree of ZHA10 gyrB

3 结论与讨论

马铃薯的种植面积日益扩大，其病害的发生也日益严重，尤其是马铃薯储藏期的病害。对储藏期的病害不宜进行化学防治，而生物防治具有定殖能力强，不污染环境等优点，适合防治储藏期马铃薯炭疽病的发生，这与赵妍，穆常青[14-15]研究表明枯草芽胞杆菌能够有效控制采后水果的多种疫病一致。目前研究也已经证明了枯草芽胞杆菌是一种理想的生防细菌[16-18]。

由于细菌16S rDNA具有高度保守性，对相似率极高的近缘种无法做进一步区分[19]，其平均碱基替换率为每5 000万年变化1%，比gyrB基因的碱基替换率每100万年变化0.7%～0.8%要慢[20]，在比较一些相似性比较高的近缘种时，gyrB基因更能准确地鉴定到种。因此，本试验通过16S rDNA、gyrB基因序列相似性分析、菌体形态观察及生理生化测定结果，将ZHA10鉴定为枯草芽胞杆菌(B.subtilis)，而这种鉴定细菌的方法也是一种快速鉴定的方法。

本试验从实验室保存的土壤细菌和内生细菌中筛选并获得了对马铃薯炭疽病具有高效拮抗作用的菌株ZHA10，在平板对峙试验中其抑制率达72.62%，抑菌机制主要是使病原菌菌丝变形、裂解。同时对早疫病菌、褐腐病菌、干腐病菌等马铃薯病原菌具有良好的抑制作用。所以，ZHA10在马铃薯病害的生物防治方面具有较好的利用价值，且该拮抗菌分离自高寒草地牧草体内，具有良好的抗(耐)低温特性，在防治马铃薯贮藏期病害中也具有优势。该拮抗菌虽然在室内抑菌能力较强，但是，其在大田防治效果、发酵工艺以及在植物体内定殖情况等方面还需进一步研究。

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ScreeningandidentificationoftheantagonisticorganismsagainstColletotrichumcoccodesonpotato

Wang Hanqi，Chang Tao，Yang Chengde，Chen Xiurong

(CollegeofGrassland,GansuAgriculturalUniversity；KeyLaboratoryofGrasslandEcosystemUniversity,MinistryofEducation；PrataculturalEngineeringLaboratoryofGansuProvince；Sino-U.S.CenterforGrazinglandEcosystemSustainability,Lanzhou730070,China)

In this study, the biocontrol strain ofColletotrichumcoccodeson potato was screened by confrontation culture method.The results showed that the strain ZHA10 had good inhibition againstC.coccodes, and the inhibition rate reached 76.43%.In order to understand the bacteriostatic mechanism of the endophytic strain ZHA10 toC.coccodesand its taxonomic status, a series of physiological and biochemical experiments were conducted.The results showed that the antibacterial activity was mainly due to hyphal deformation and cracking.ZHA10 was short rod-shaped, gram-positive, and (0.5-0.75) μm×(1.5-3.1)μm in size, with endospores growing from the center to the tip.Through 16S rDNA andgyrBgene sequence analysis, ZHA10 was identified asBacillussubtilis.Besides, ZHA10 could effectively inhibit the growth ofAlternariasolani,Fusariumoxysporum,Fusariumsolani,Bipolarissorokiniana,FusariumoxysporumandStysanusstemonitis, which showed that ZHA10, with broad spectrum and high antagonistic activity against pathogenic fungi, had good potential for development and application.

Colletotrichumcoccodes; biocontrol strain; screening; identification

2013-05-24

： 2013-08-27

国家自然科学基金(31160122)

S 435.32

： ADOI： 10.3969/j.issn.0529-1542.2014.01.006

* 通信作者 E-mail:yangcd@gsau.edu.cn