甘肃省马铃薯枯萎病(Fusariumavenaceum)鉴定及其病原生物学特性

王玉琴，杨成德，陈秀蓉，薛 莉，苏建红

(甘肃农业大学草业学院， 草业生态系统教育部重点实验室， 甘肃省草业工程实验室，

甘肃省马铃薯枯萎病(Fusariumavenaceum)鉴定及其病原生物学特性

王玉琴，杨成德*，陈秀蓉，薛 莉，苏建红

(甘肃农业大学草业学院， 草业生态系统教育部重点实验室， 甘肃省草业工程实验室，

中-美草地畜牧业可持续发展研究中心，兰州 730070)

对甘肃省马铃薯枯萎病菌进行了分离、鉴定及培养特性的研究。结果表明，该病原菌大型分生孢子镰刀形，无色，多细胞，大小为(12.5～30)μm×(2.5～5)μm；小型分生孢子数量较多，无色，卵圆形或椭圆形，大小为(4.70～12.94)μm×(1.76～2.35)μm；ITS序列分析表明，病原菌与Fusariumavenaceum(JN6317483)亲缘关系最近，相似性达到100%，结合形态特征鉴定该病原菌为燕麦镰刀菌(Fusariumavenaceum)。该病原菌在5～40 ℃范围内均可生长，最适温度为20 ℃；供试的碳、氮源中，果糖和亮氨酸对该菌菌丝生长有显著的促进作用(P<0.05)，而显著抑制菌丝生长的是氯醛糖和碳酸铵(P<0.05)；不同类型培养基中，燕麦片培养基对菌丝生长有显著促进作用(P<0.05)。

马铃薯； 枯萎病； 鉴定； 培养性状

马铃薯作为一种块茎类粮蔬兼用食品，具有重要的营养价值和经济价值[1-2]。甘肃是我国马铃薯主要产区之一，马铃薯在全省各地均有种植，并以中部干旱区、高寒阴湿二阴区为中心，形成陇南湿润山区至河西灌区东部连成一片的马铃薯主产区[3]。近年来，随着马铃薯种植面积不断扩大，病害种类不断增多，危害逐年加重，严重制约马铃薯生产及其加工产业的健康发展。据报道，世界范围内马铃薯真菌性病害已有33种，在我国危害较重、造成损失较大的有10余种[4]，2010年在甘肃省马铃薯产区调查时发现疑似马铃薯枯萎病发生。马铃薯枯萎病菌以菌丝体或厚垣孢子随病残体在土壤中或病薯上越冬。翌年病部产生的分生孢子借雨水或灌溉水传播，从伤口侵入。田间湿度大、土温高于28 ℃或重茬地、低洼地易发病[5]。因此，本试验以传统的形态学特征结合rDNA-ITS序列分析，从分子生物学水平上明确甘肃省马铃薯枯萎病的病原，并且研究了其培养性状，以期为该病的田间诊断和综合防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 大田症状描述及病原分离与纯化

在武威市天祝县和定西市对典型枯萎病症状进行描述后，采集马铃薯茎秆和薯块带回实验室，按照常规的组织分离法分离病菌，在PSA培养基(马铃薯200 g，蔗糖15 g，琼脂17 g，蒸馏水1 000 mL)上进行培养与纯化，将纯化获得的菌株黑暗培养，待产孢后进行单孢分离，进一步纯化后移入PSA斜面培养保存备用[6]。

1.2 致病性测定

将产孢的供试菌株用无菌水配制成孢子悬浮液(约 106个/mL)，在室温条件下，采用灌根法将分生孢子悬浮液均匀浇灌在种有健康新大坪块茎的灭菌土壤中，3次重复，以无菌水为对照。等长出幼苗后，连续观察马铃薯的发病情况，形成典型症状后，对病原菌进行再分离，按柯赫氏法则确定病原菌[7]。

1.3 病原菌的鉴定

1.3.1 形态学鉴定

将菌株培养产孢后，在显微镜下观察分生孢子梗和分生孢子特征，测定100个分生孢子的大小，并在显微镜下拍照[8]。根据病原菌形态特征，参考相关文献[9]进行病原菌种的鉴定。

1.3.2 rDNA-ITS的扩增与序列分析

1.3.2.1DNA的提取

将供试菌株接种于PDB液体培养基中，于25 ℃下培养7～9 d后收集菌丝，充分研磨后，用UNIQ-10柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司)提取DNA，经电泳检测具特异性条带的DNA提取物进行PCR扩增。

1.3.2.2PCR扩增

采用通用引物ITS1(5′-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3′)和ITS4(5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′)。其扩增体系为：10×PCR Buffer 5.0 μL，TaqDNA聚合酶(2 U/μL) 1.2 μL，引物ITS1(10mmol/L)和ITS4(10mmol/L)各2.0 μL，dNTP(10mmol/L)3.0 μL， DNA模板(10 ng/μL)2.0 μL，最后用ddH2O定容到50 μL。PCR扩增程序为：95 ℃预变性4 min，94 ℃变性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸5 min，共35个循环；最后72 ℃延伸10 min[10]。取0.4 μL的PCR扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测后，委托上海生工生物有限公司进行DNA纯化和测序，将测序结果与GenBank中核酸数据库中的ITS区相关序列进行同源性比较，明确其系统发育地位。

1.4 生物学特性研究

1.4.1 不同温度对菌丝生长的影响

采用生长速率法。将已经活化好的病原菌用0.4 cm直径的打孔器切取菌饼，置于PSA平板中央，置于0、5、10、15、20、25、30、35、40 ℃和45 ℃下培养，重复5次，5 d后用十字交叉法测量菌落直径，并对所得数据用SPSS软件进行方差分析。

1.4.2 不同碳氮源对菌丝生长的影响

在含1%的碳源(葡萄糖、乳糖、D-树胶醛糖、麦芽糖、氯醛糖、D-半乳糖、蔗糖、可溶性淀粉、甘露糖、D-木糖、 D-果糖、不加糖)以及在含0.2%葡萄糖的马铃薯琼脂培养基中加入0.25%氮源(氯化铵、硝酸铵、碳酸铵、硝酸钠、L-谷氨酸、尿素、大豆蛋白胨、L-组氨酸、 L-精氨酸、亮氨酸、蛋白胨、甘氨酸、不加氮源)培养基上培养菌株，20 ℃下培养，分别以不加碳氮源为对照[11]，其他同1.4.1。

1.4.3 不同培养基对菌丝生长的影响

在不同培养基(燕麦片、理查固体、麦芽糖、玉米粉、PDA、查彼固体、PSA、麦芽琼脂、孟加拉红琼脂、水琼脂共10种，参考文献[6]配制)上培养病原菌，3次重复，5 d后用十字交叉法测量菌落直径， 其他同1.4.1。

2 结果与分析

2.1 症状描述

马铃薯枯萎病在生长期及贮藏期均可发病。生长期首先从植株下部叶片出现萎蔫，逐渐向上扩展，初期早晚可恢复，中午萎蔫(图1-a、b)；植株茎部维管束变褐色，严重时全株枯死(图1-c)；块茎发病时，块茎上多呈现表面斑点，剖开病薯，可看到从蒂部维管束开始变褐色和扩展(图1-d)。贮藏期块茎发病症状与生长期一致(图1)。

图1 马铃薯枯萎病症状Fig.1 Symptoms of potato wilt

2.2 病原菌的分离及致病性测定

从多个发病薯块上采用常规组织分离法分离获得多个真菌分离物，但其培养性状及菌丝形态均一致，因此合并为一个真菌分离物。将该真菌分离物的悬浮液接种于种植健康马铃薯块茎的无菌土壤中，经连续观察，在马铃薯生长中后期开始发病，植株萎蔫(图2-b)，剖开茎秆，茎秆维管束变褐；切开块茎，可见其内维管束组织变褐(图2-c、d)，其发病症状与田间症状一致(图2)。从发病茎秆和块茎上均可再分离得到与原接种菌株相同的真菌分离物。根据柯赫氏法则，确定该分离物为马铃薯枯萎病的致病菌株。

图2 病原致病性测定Fig.2 Pathogenicity test of the pathogen tested

2.3 病原菌鉴定

2.3.1 病原菌的形态特征

病原菌在PSA培养基上菌落粉红色、桃红色，菌落隆起，繁茂(但非稀疏)，较厚，致密，菌落中部为橙黄色层，四周菌丝白色，菌背紫红色(图3-a、b)。分生孢子无色透明，大型分生孢子镰刀形，稍弯曲，两端渐细，具2～5个隔膜，多为3个，大小为(12.5～30)μm×(2.5～5)μm；小型分生孢子长椭圆形、肾形，单孢、双孢，大小(4.70～12.94)μm×(1.76～2.35)μm，数量较多(图3-c、d)。根据形态学特征，参考相关文献[12-13]，将病原菌初步鉴定为镰孢属真菌(Fusariumsp.)。

2.3.2 rDNA-ITS序列分析

提取该病原菌的基因组DNA，经电泳检测具特异性条带(图4)，可以进行PCR扩增。利用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增，扩增产物用1.2% 琼脂糖凝

胶电泳检测，以DNA Marker-DL2000为对照，在500 bp附近有一条明显的扩增条带，与预期ITS rDNA目的片段大小相符(图5)，将该扩增产物送上海生工测序，所得ITS-rDNA序列为553 bp。登录Internet网(http:∥www.ncbi.nlm.nih gov/blast.cgi)，将菌株的rDNA-ITS基因序列在GenBank中进行同源序列比较，该病原菌与GenBank中各菌株F.acuminatum(JX114788)、F.oxysporum(EU520062)、Gibberellaavenacea(GU934530)、F.avenaceum(JN631748)、F.tricinctum(JX179207)、G.avenacea(EU255796)的相似性都在99%以上，下载相似性最高的序列，并用ClustalX(1.8)软件进行多重序列比较后，再用Mega(4.0)软件采用邻接法构建了系统发育树，该病原菌与燕麦镰孢菌(F.avenaceum)(JN631748)聚在一起(图6)，即其亲缘关系最近，结合形态学特征，进一步鉴定其为燕麦镰孢菌(Fusariumavenaceum)。

图3 病菌形态特征Fig.3 Morphological characters of the pathogen

图4 DNA的提取Fig.4 DNA extraction

2.4 病原菌的生物学特性

2.4.1 温度对菌丝生长的影响

试验结果表明(图7)，病原菌在5～40 ℃范围内均可生长，20 ℃时菌落生长速率显著高于其他温度处理(P<0.05)，为最适生长温度，5～20 ℃之间随温度增加菌丝生长速率增加，高于20 ℃，菌落生长速率逐渐下降，在0 ℃和45 ℃下均不能生长。

2.4.2 碳源对菌丝生长的影响

表1表明，以果糖为碳源菌丝生长最快，其次为木糖、麦芽糖、甘露糖，4种碳源间无显著差异，但均显著高于其他碳源(P<0.05)，且麦芽糖、甘露糖与D-半乳糖差异极不显著(P<0.01)；菌丝生长速度最慢的是氯醛糖，氯醛糖与蔗糖、可溶性淀粉和CK差异不显著(P<0.05)，且与乳糖、树胶醛糖、CK、可溶性淀粉、蔗糖差异极不显著(P<0.01)。

图5 ITS-rDNA序列的扩增Fig.5 PCR product of ITS-rDNA

图6 病原菌的系统发育树Fig.6 Phylogenetic tree of Fusarium sp.based on the sequences of 16S rDNA

图7 温度对菌丝生长的影响Fig.7 Effects of temperature on mycelial growth of Fusarium avenaceum

2.4.3 氮源对菌丝生长的影响

表1表明，与对照相比，亮氨酸对该菌菌丝生长有显著的促进作用(P<0.05)；氯化铵、硝酸铵、硝酸钠对菌丝生长也有促进作用，但与对照差异不显著。大豆蛋白胨、蛋白胨、L-谷酸氨、甘氨酸、L-组氨酸、L-精氨酸、尿素、碳酸铵对该菌的生长有抑制作用，其中碳酸铵，尿素显著抑制该菌生长(P<0.05)，但尿素与L-精氨酸的差异不显著(P<0.05)，且与L-精氨酸、L-组氨酸、甘氨酸的差异极不显著(P<0.01)。

表1不同碳、氮源对菌丝生长的影响

Table1Effectsofcarbon-sourceandnitrogen-sourceonthemycelialofFusariumavenaceum

碳源C⁃source菌落直径/cmColonydiameter氮源N⁃source菌落直径/cmColonydiameterD⁃果糖D⁃fructose7．72aAD⁃木糖D⁃xylose7．43aA麦芽糖Maltose7．36aAB甘露糖Mannose7．35aABD⁃半乳糖D⁃galactose5．84bBC葡萄糖Glucose5．80bC乳糖Lactose5．47bcCDD⁃树胶醛糖D⁃gummose5．31bcCDCK(不加糖)5．15bcdCD可溶性淀粉Solublestarch4．78bcdCD蔗糖Sucrose4．45cdCD氯醛糖Chloralose4．03dD亮氨酸Leucine8．04aA 氯化铵Ammoniumchloride7．36abAB硝酸铵Ammoniumnitrate7．27abAB硝酸钠Sodiumnitrate7．04abcABCK6．88bcAB大豆蛋白胨Soybeanpeptone6．16bcdBC蛋白胨Peptone6．08cdBCL⁃谷氨酸Glutamicacid5．22deCD甘氨酸Glycine5．01deCDEL⁃组氨酸L⁃histidine5．00deCDEL⁃精氨酸L⁃arginine4．36efDE尿素Urea3．57fE碳酸铵Ammoniumcarbonate0．4gF

1) 标小写字母者表示在P<0.05水平差异显著，标大写字母者表示在P<0.01水平差异显著。下同。 The different letters indicate significance atP<0.05 andP<0.01 levels in different media forFusariumavenaceum.The same below.

2.4.4 不同培养基对菌丝生长的影响

从表2可知，不同培养基上菌落的生长速率依次为：燕麦片>理查固体>麦芽糖>玉米粉>PDA>查彼固体>PSA>麦芽琼脂>孟加拉红琼脂>水琼脂，且在燕麦培养基上菌落的生长速率显著高于其他培养基(P<0.05)，即燕麦片培养基有利于该病原菌菌丝的生长；菌丝在水琼脂培养基上生长速率显著低于其他培养基(P<0.01)。

表2不同培养基对菌丝生长的影响

Table2EffectsofmediaonmycelialgrowthofFusariumavenaceum

培养基Medium菌落直径/cmColonydiameter培养基Medium菌落直径/cmColonydiameter燕麦片Oatmeal7．87aA理查固体Richardsolid6．84bAB麦芽糖Maltose6．80bAB玉米粉Maizemedium6．44bcBCPDA6．26bcdBC查彼固体Czapekmedium5．55cdeBCDPSA5．34deCDE麦芽琼脂Maltagar4．82efDE孟加拉红琼脂Rosebengalagar4．24fEF水琼脂Wateragar3．05gF

3 讨论

据Rakhimov和Khakimov报道[14]，马铃薯枯萎病是由镰刀菌的5 个不同种引起的，即茄病镰刀菌[Fusariumsolani(Mart.)]、尖孢镰刀菌(F.oxysporumSchl.)、串珠镰刀菌(F.moniliformeSheld.)、雪腐镰刀菌[F.nivale(Fr.)Ces.]、接骨木镰刀菌(F.sambucinumFuck.)。彭学文等[15]报道，河北省马铃薯枯萎病是由茄病镰刀菌(F.solani)、串珠镰刀菌(F.moniliforme)以及尖孢镰刀菌(F.oxysporum)引起的。薛玉凤等[16]报道，内蒙古地区发现的马铃薯枯萎病病原菌有尖孢镰刀菌(F.oxysporum)、茄病镰刀菌(F.solani)和三线镰刀菌[F.tricinctum(Fr.)Sacc.]。王晓丽等[17]对马铃薯枯萎病初侵染来源及栽培与发病的关系进行了研究，得到合理施肥均能延缓植株发病，采用覆膜起垄栽培可以有效降低病薯率。但是，为有效控制马铃薯枯萎病的发生，必须清楚引起病害发生的病原菌种类，以及发病条件，进而制定有效的防治措施。

本试验通过病原分离、致病性测定以及形态学鉴定、ITS序列分析等方法，将分离自武威市天祝县和定西市的马铃薯枯萎病菌鉴定为燕麦镰刀菌，此为首次报道该种可以引起马铃薯枯萎病。生物学研究表明，该病原菌能够在5～40 ℃条件下生长，生长的最适温度为20 ℃，温度过高或过低对菌丝生长均不利，此结果可为该病害的防治提供理论依据。该病原菌的菌丝在5～10 ℃条件下均可缓慢生长，但差异不显著，此结果说明在贮藏条件下，马铃薯枯萎病仍有可能发病，为马铃薯贮藏期病害防治提供了一定依据。

不同碳、氮源对菌丝生长的影响存在显著差异。在供试碳氮源中，最佳碳源是果糖和木糖、麦芽糖、甘露糖，最佳氮源是亮氨酸，氯化铵、硝酸铵、硝酸钠对菌丝生长也有促进作用，但差异不显著，碳酸铵、尿素、L-精氨酸抑制该病原菌的生长。根据不同碳、氮源对菌丝生长的影响，在实际生产中可以使用对病原菌生长有显著抑制作用的碳氮源作为肥料，减缓病害的发生。

马铃薯枯萎病病原方面仅王丽丽[2]报道了新疆乌昌地区有该病害发生，本文首次确认了燕麦镰刀菌可以引起马铃薯枯萎病，并详细研究了其生物学特性，为该病害的田间诊断和综合防治提供了依据。

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IdentificationofpotatowiltcausedbyFusariumavenaceumandthebiologicalcharacteristicsofitspathogen

Wang Yuqin，Yang Chengde，Chen Xiurong，Xue Li，Su Jianhong

(CollegeofGrassland,GansuAgriculturalUniversity;KeyLaboratoryofGrasslandEcosystem,MinistryofEducation;PrataculturalEngineeringLaboratoryofGansuProvince;Sino-U.S.CenterforGrazinglandEcosystemSustainability,Lanzhou730070,China)

The pathogen causing potato wilt were isolated and identified by the rDNA-ITS sequences and biological characteristics in Gansu Province.The results showed that the macroconidia were hyaline, sickle-shaped, multi-cellular, and the size was (12.5-30)μm × (2.5-5)μm.The microconidia were oval, and the size was (4.70-12.94) μm×(1.76-2.35)μm.The rDNA-ITS sequence of the pathogenic fungus shared 100% similarity with that ofFusariumavenaceum(JN6317483).The morphologic characteristics and ITS sequence analysis all indicated that the pathogenic fungus wasF.avenaceum.The suitable culture temperature was from 5 ℃ to 40 ℃, and the optimum was 20 ℃.D-fructose and leucine had significant promoting effect on the growth of the mycelia (P<0.05), and chloralose and ammonium carbonate significantly inhibited mycelial growth (P<0.05).Oatmeal medium played a significant role in promoting mycelial growth (P<0.05).

potato；Fusariumwilt； identification； culture characteristics

2013-04-11

： 2013-06-17

甘肃省农牧厅项目

S 435.32

： ADOI： 10.3969/j.issn.0529-1542.2014.01.008

* 通信作者 E-mail:yangcd@gsau.edu.cn