小麦品种抗条锈病基因Yr10、Yr18及1BL/1RS易位的分子检测

张玉薇，刘 博，刘太国*，高 利，陈万权*

(1.云南农业大学，昆明 650201；2.植物病虫害生物学国家重点实验室，中国农业科学院植物保护研究所，北京 100193)

小麦品种抗条锈病基因Yr10、Yr18及1BL/1RS易位的分子检测

张玉薇1，2，刘 博2，刘太国2*，高 利2，陈万权2*

(1.云南农业大学，昆明 650201；2.植物病虫害生物学国家重点实验室，中国农业科学院植物保护研究所，北京 100193)

利用抗条锈病基因Yr10、Yr18以及1BL/1RS易位的SCAR或STS标记，对2006-2010年75份国家审定的小麦品种进行了分子检测，以明确Yr10、Yr18以及1BL/1RS易位在我国2006-2010年审定小麦品种资源中的分布。结果显示：75份材料中有13份检测到Yr10基因的标记，1份检测到Yr18基因的标记，分别占参试材料的17.3%和1.3%，只有‘西农928’能同时检测到Yr10和Yr18基因；25份含有1BL/1RS易位片段，占参试材料的33.3%。表明1BL/1RS易位在我国小麦育种中利用率仍然较高，对目前流行条锈菌小种有良好抗性，而表现慢锈性的Yr18在小麦育种的利用率较低，建议在我国小麦育种中加强利用。

小麦； 分子标记； 抗条锈病基因； 1BL/1RS易位。

小麦是世界上总产量仅次于玉米的第二大粮食作物，而我国是世界小麦第一大生产国，小麦产量在世界小麦总产量中占有重要比重[1]。2012年联合国粮农组织发布的《农作物前景和粮食形势》报告中指出，我国小麦产量预测数据为1.174亿t，约占世界小麦产量的17%[2]。近年来，随着全球气候变暖等气候条件的变化，小麦条锈病呈流行趋势，严重威胁着小麦的高产和稳产[3]。选育并推广抗病品种为防治小麦条锈病最为经济、安全和有效的方法[4]。

分子标记是一项发展迅速的生物技术，常用于分子辅助选择育种和快速检测特定目标性状基因。它以DNA形式直接表现，不受环境和待测品种的基因表达情况的限制[5]。祁旭升[6]、杨文雄[7]、王欣[8]、曹世勤[9]等众多专家学者曾利用分子标记对我国小麦品种的抗条锈基因进行研究分析，证实了分子标记在小麦品种抗条锈基因研究中有重要应用价值，现已被广泛使用。

Yr10最早由Metzger等[10]在小麦种质P.I.178383中发现，是位于小麦1B染色体上的显性抗病基因，对中国目前出现的大部分条锈菌生理小种都具有良好抗性[11]。邵映田等[12]利用AFLP方法成功地找到了与Yr10紧密连锁的分子标记，并转化为稳定的SCAR标记SC200，该SCAR标记与Yr10的连锁距离为0.5 cM。Yr18是成株抗性基因，与Lr34和Pm38紧密连锁，慢条锈性表现稳定，具有一定的利用价值[13]。引物sclv34为Yr18的共显性标记，具有准确性高，重复性好等特点。该标记与Yr18的连锁距离为2.5 cM[14]，可用于小麦品种Yr18分子标记的辅助选育，Lagudah等[14]、Kolmer等[15]、祁旭升等[6]学者先后利用sclv34对各地小麦种质进行了抗条锈基因Yr18的分子检测。杨文雄等[14]研究表明，我国农家品种中Lr34/Yr18分布相当广泛，但在育成品种中只有‘南大2419’、‘内乡5号’等少数品种含有Lr34/Yr18。

1BL/1RS易位系源于黑麦，具有良好的抗逆性、适应性和丰产性，是外缘种质用于小麦育种最成功的范例[16]。国际玉米小麦改良中心(CIMMYT)约45%的高代品系属于该易位类型[17]。1BL/1RS易位片段上带有抗条锈、秆锈、叶锈和白粉病的基因(Yr9、Sr31、Lr26和Pm8)，曾作为小麦真菌病害的抗源在育种工作中起重要作用[18]。

本研究利用小麦Yr10、Yr18基因和1BL/1RS的SCAR或STS分子标记，对2006-2010年我国国审小麦品种的75份材料进行检测，以了解这些基因和1BL/1RS易位片段在我国国审小麦品种中的分布，为小麦品种改良提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

供试75份小麦品种来自于2006-2010年国家审定小麦品种，阳性对照材料为‘Avocet S*6/Yr10’、‘Avocet S*6/Yr18’以及携带1BL/1RS易位片段的‘Avocet S*6/Yr9’近等基因系，阴性对照材料为‘Avocet S’、‘铭贤169’。其中Avocet S系列由澳大利亚悉尼大学植物育种所培育，所有小麦品种均由中国农业科学院植物保护研究所麦类病害组收集、繁存。

1.2 引物序列的合成

Yr10、Yr18及1BL/1RS易位的STS或SCAR分子标记引物(表1)由上海生工生物工程有限公司合成。

表1引物序列

Table1Primersequences

检测目标Target引物名称Primername引物序列(5′⁃3′)Primersequence(5′⁃3′)退火温度/℃Annealingtemperature参考文献Reference1BL/1RSAF1AF4GGAGACATCATGAAACATTTGCTGTTGTTGGGCAGAAAG60Francisetal[19]Yr10SC200FSC200RCTGCAGAGTGACATCATACATCGAACTAGTAGATGCTGGC60Shaoetal[12]Yr18sclv34Fsclv34RGTTGGTTAAGACTGGTGATGGTGCTTGCTATTGCTGAATAGT60Lagudahetal[14]

1.3 基因组DNA的提取

采用CTAB方法[20-22]提取小麦叶片DNA，使用Nano Drop(ND-1000)测定DNA浓度，并稀释至终浓度30 ng/μL。

1.4 PCR扩增及电泳检测

PCR反应体系为10 μL，包含6 μL 2×TaqPlus PCR Master Mix，每条引物(5 μmol/L)各0.5 μL，模板DNA(30 ng/μL)90 ng。其中Yr10的反应程序[21]为：94 ℃变性3 min；94 ℃变性1 min，60 ℃退火1 min, 72 ℃延伸1.5 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。Yr18的反应程序为：95 ℃变性5 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，35个循环；72 ℃延伸7 min。1BL/1RS的反应程序为：94 ℃变性3 min，94 ℃变性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。扩增产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色后在UVI pro紫外凝胶成像系统上观察并拍照。

2 结果与分析

2.1 Yr10和Yr18的分子检测及其分析

邵映田等[12]研究表明，Yr10的引物SC200在含Yr10的品种上能检测出200 bp和180 bp两条带，不含Yr10的品种只能检测出180 bp一条带。本试验应用SCAR标记对部分供试材料进行PCR扩增(图1)，结果发现，在近等基因系‘Avocet S*6/Yr10’上能检测出200 bp和180 bp两条带，感病品种‘铭贤169’只能检测出180 bp一条带。75份材料中，‘新麦26’、‘苏育麦1号’等13份品种能够检测出200 bp和180 bp两条带，推测这些品种含有Yr10基因，约占检测样本的16.0%。其余57份材料均检测到非抗性标记带，推测这些品种不含Yr10基因。其中，‘周麦22’的检测结果与董淑静等[23]检测结果一致。所有供试材料Yr10基因的分子检测结果见表2。

图1 部分供试小麦品种的Yr10 SCAR标记扩增结果Fig.1 PCR detection of Yr10 by SCAR marker in partial tested wheat cultivars

Kolmer[15]等研究表明，利用引物sclv34对小麦抗条锈病基因Yr18进行分子检测，在近等基因系‘Avocet S*6/Yr18’上能扩增出150 bp的特征条带，感病品种‘Avocet S’能扩增出229 bp的片段。本试验应用引物sclv34对供试材料进行PCR扩增(图2)，在阴性对照‘铭贤169’上不能扩出任何片段，在阳性对照品种‘Avocet S*6/Yr18’和阴性对照‘Avocet S’的扩增条带与上述研究一致。在全部待测品种中，仅有‘西农928’扩出扩增出150 bp的片段，推测‘西农928’含有Yr18，占检测品种的1.3%；其余74份材料未扩增出特征条带，推测这些品种中均不含有Yr18基因。

图2 部分供试小麦品种的Yr18 SCAR标记扩增结果Fig.2 PCR detection of Yr18 by SCAR marker in partial tested wheat cultivars

2.2 1BL/1RS易位的分子检测及其分析

根据之前的研究结果[9，19]，1BL/1RS易位的SCAR引物AF1/AF4能扩增出1.5 kb的抗性标记带。图3可以看出，阳性对照‘Avocet S*6/Yr9’能扩出1.5 kb的条带，阴性对照‘Avocet S’不能扩出此条带。75份材料中，‘石麦15号’、‘京冬17’等24份材料能扩出1.5 kb的特征带，推测这些小麦品种含有1BL/1RS易位片段，约占检测样本的33.3%。所有供试材料1BL/1RS易位片段的分子检测结果见表2。

系谱分析得知，‘京花9号’、‘石麦19’、‘京冬17’、‘京冬18’均为‘洛夫林10’的后代，它们的1BL/1RS易位可能来自‘洛夫林10’；‘邢麦6号’和‘邯麦13号’的1BL/1RS易位来自‘山前麦’；‘山农优麦2号’的亲本含有‘牛朱特’，它的1BL/1RS易位可能来自‘牛朱特’。

图3 部分供试小麦品种1BL/1RS易位的STS标记扩增结果Fig.3 PCR detection of 1BL/1RS translocation by STS in partial tested wheat cultivars

表2 75份小麦品种的Yr10、Yr18及1BL/1RS易位的分子检测1)Table 2 Molecular detection results of Yr10 and Yr18 and 1BL/1RS translocation in 75 wheat cultivars

续表2Table2(Continued)

编号No．品种Cultivar品种来源Cultivarorigin选育省市Place检测结果Detectionresults1BL/1RSYr10Yr1837淮麦29淮麦20/绵阳04254江苏+--38浚麦99⁃798264/豫麦52河南鹤壁-+-39郑育麦9987豫麦21/豫麦2号∥豫麦57河南郑州+--40轮选988矮败小麦轮回选择群体河南新乡---41新麦21偃展1号/新麦9号河南新乡---42山农17L156/莱州137山东泰安---43冀5265冀5006/9204河北+--44邯麦13号山农太91136/冀麦36河北邯郸+--45石麦19号石4185∥(烟辐188/临8014)F2河北石家+--46河农6049石6021/河农91459河北+--47洛旱11豫麦25号/山农45河南洛阳+--48山农优麦2号PH85⁃115⁃2∥79401/鲁麦11号山东++-49洛旱9号豫麦49/山农45河南洛阳+--50洛旱13洛旱2号/晋麦47河南洛阳---51河农825临远95⁃3019/石4185河北+--52绵麦3671275⁃1/99⁃1522四川---53扬麦20扬麦10号/扬麦9号江苏---54南农0686MV964091/宁麦9号江苏---55山农19(83(3)⁃113/1604)F3∥886059山东-+-56山农20PH82⁃2⁃2/954072山东---57新麦26新麦9408/济南17河南新乡-+-58苏育麦1号烟1668/鲁麦21号江苏连云港-+-59郑麦9962豫麦18/Ta971832河南+--60鲁垦麦9号徐9935/烟优361山东---61郯麦98济宁13/942山东---62运旱618运旱92⁃18/新春9号山西---63沧麦6005临汾6154/321⁃4⁃6河北沧州---64保麦10号石4185/96Y6河北保定---65京冬18F404/(长丰1/ore∥双82⁃4/81⁃142)∥931北京+--66中麦415贵农11/京411∥京411北京---67克旱20克89⁃46/Cundo黑龙江---68辽春18号辽春10号变异株系选辽宁---69辽春20号铁春2号/8452辽宁-+-70航麦96号辽春10号变异株系选辽宁-+-71巴丰5号永1087∥Y2008⁃6/巴麦10号内蒙古+--72晋春15号YecorarF70/晋春9号山西---73陇春27号8858⁃2/陇春8号甘肃+--74高原412高原602/181∥临汾5309青海-+-75赤麦7号B37/94⁃5内蒙古赤峰-+-

1) + 表示存在；-表示不存在。 + Indicate presence，-indicate absence.

3 讨论与结论

3.1 分子检测的有效性及准确性分析

近年来，DNA分子标记技术操作方便，且检测不受季节和环境条件的影响，因而在小麦抗条锈遗传研究中发掘基因紧密连锁的DNA标记，并通过标记辅助选择育成了一批有价值的种质。试验中采用的分子标记SC200与Yr10紧密连锁，与Yr10遗传距离为0.5 cM[12]；引物sclv34为Yr18的共显性标记，与Yr18遗传距离为2.5 cM[15]，两个分子标记与基因间的遗传距离均小于3 cM，因此检测结果有重要参考价值。在75个品种的分子检测中，只有‘西农928’同时检测到Yr10、Yr18基因的标记位点，建议加快推广利用。1BL/1RS易位系是由黑麦染色体1R的短臂上通过染色体易位转入普通小麦1B染色体上形成的，而本试验选用了Francis[18]等研究的黑麦染色体臂1BL/1RS易位的引物AF1/AF4为探针，提高了分子检测的准确度。

3.2 各地待测品种中基因Yr10、Yr18的利用情况

Yr10对我国目前流行的条锈菌小种具有良好的抗性，王凤乐等[24]对我国绵阳系小麦抗条锈病调查表明，Yr10对中国近年来的优势生理小种条中30和条中31号表现免疫，井长勤等[25]对我国重要小麦品种抗条锈基因的分析中未能找到含有Yr10品种。从本试验检测结果可以看出，我国国审小麦品种中含Yr10的品种占检测品种的17.3%，主要分布在河南，有4个小麦品种，分别是‘周麦22号’、‘周麦23号’、‘浚麦99-7’、‘新麦26’，占所有Yr10品种的20.1%；其次是山东和辽宁，均占有10.5%，分别是‘山农优麦2号’、‘山农19’和‘辽春20号’、‘航麦96号’；再者，陕西的‘西农928’，青海的‘高原412’，内蒙古的‘赤麦7号’，安徽的‘皖麦52号’，江苏的‘苏育麦1号’均检测出含有Yr10基因。总体看来，Yr10基因在目前中国的国审小麦品种中很少被利用，有的小麦生产大省如来自河北的选育品种中未检测到Yr10，因此，为更好地防治小麦条锈病，应加强抗锈性表现良好的抗性基因Yr10在小麦育种上的利用。

李在峰等[26]研究发现成株抗性基因Yr18在生产上应用可减少条锈病毒性生理小种的危害。杨文雄等[7]对我国234份育成品种检测中仅有14份材料携带Yr18。本试验中75个待测品种中仅有一个品种即陕西的‘西农928’检测出Yr18。说明在我国小麦育种中，基因Yr18的利用率比较低，因此，在以后的育种中，可以利用分子标记进行辅助育种，加大对基因Yr18等慢锈基因的有效利用，提高品种的抗性水平。

3.3 1BL/1RS品种的分布情况及其原因

从抗性基因在生产品种中出现的频率看，在当前生产上的小麦品种中所具有的抗条锈基因以Yr9所占比例最大，这与中国小麦品种1BL/1RS易位系的利用有关[27]。70年代初，我国从罗马尼亚引入了一些含有1BL/1RS易位系小麦品种如‘洛夫林10号’、‘洛夫林13’、‘洛夫林18’、‘山前麦’、‘高加索’、‘阿芙乐尔’等作为我国小麦育种的骨干亲本[28]。本试验中1BL/1RS易位系占有33.3%，主要分布在河北，包括‘石麦15号’、‘邢麦6号’、‘金禾9123’、‘冀5265’等8个品种，占所有1BL/1RS品种的32%，河南占有28%，包括‘金麦8号’、‘漯麦9号’、‘洛旱11’、‘许科1号’等7个品种；其次是北京占有16%，江苏占有12%，它们分别是‘京冬17’、‘京冬22’、‘京花9号’、‘京冬18’和‘淮麦21’、‘淮麦28’、‘淮麦29’；另外，山东的‘山农优麦2号’，内蒙古的‘巴丰5号’，甘肃的‘陇春27号’也检测出有1BL/1RS易位。随着1BL/1RS品种被大量利用，其品种已逐渐对新的生理小种丧失了抗性，并且1BL/1RS小麦品种加工的面团耐揉性弱、面团发黏，面团品质变劣[29]。因此1BL/1RS品种在育种选择亲本时谨慎使用。

[1] 孟令杰, 张红梅.中国小麦生产的技术效率地区差异[J].南京农业大学学报, 2004, 4(2): 13-16.

[2] 彭玲玲.‘郑麦366’小麦种子中的明星[N].中国科技奖励, 2012(3): 21.

[3] 赵中华.2003年全国小麦条锈病的流行特点及治理策略[J].中国植保导刊, 2004, 24(2): 16-18.

[4] Line R F.Stripe rust of wheat and barley in north America: A retrospective historical review[J].Annual Review of Phytopathology, 2002, 40(1): 75-118.

[5] 石运庆, 牟秋焕, 李鹏, 等.DNA分子标记及其在作物遗传育种中的应用[J].山东科学, 2005, 18(2): 22-29.

[6] 祁旭升, 王晓娟, 陈伟英, 等.人工合成小麦新种质抗条锈性鉴定与Yr18基因检测[J].植物保护, 2008, 34(4): 26-30.

[7] 杨文雄, 杨芳萍, 梁丹, 等.中国小麦育成品种和农家种中慢锈基因Lr34/Yr18的分子检测[J].作物学报, 2008, 34(7): 1109-1113.

[8] 王欣, 张怀刚, 刘宝龙, 等.青海省小麦品种中Yr10和Yr15基因及其1BL/1RS易位的分子检测[J].西北植物学报, 2011, 31(1): 57-63.

[9] 曹世勤, 贾秋珍, 黄瑾, 等.甘肃省50个主要小麦品种(系)苗期抗条锈基因推导及成株期抗病性分析[J].作物学报, 2011, 37(8): 1360-1371.

[10]Metzger R, Silbaugh B.Inheritance of resistance to stripe rust and its association with brown glume color inTritieumaestivumL.P.I 178383[J].Crop Science, 1970, 10(5): 567-568.

[11]王凤乐，吴立人，徐世昌，等.中国条锈菌新小种条中30、31号的研究[J].植物保护学报, 1996, 23(1): 39-44.

[12]邵映田, 牛永春, 朱立煌, 等.小麦抗条锈病基因Yr10的AFLP标记[J].科学通报, 2001, 46(8): 669-672.

[13]Singh R, Huerta-Espino J, Rajaram S, et al.Achieving near-immunity to leaf and stripe rusts in wheat by combining slow rusting resistance genes[C].Proceedings of The 10th Cereal Rusts and Powdery Mildews Conference, 2000.

[14]Lagudah E, McFadden H, Singh R, et al.Molecular genetic characterization of theLr34/Yr18 slow rusting resistance gene region in wheat[J].Theoretical and Applied Genetics, 2006, 114(1): 21-30.

[15]Kolmer J A, Singh R P, Garvin D F, et al.Analysis of the rust resistance region in wheat germplasm[J].Crop Science, 2008, 48(5): 1841-1852.

[16]Ehdaie B, Whitkus R, Waines J.Root biomass, water-use efficiency, and performance of wheat-rye translocations of chromosomes 1 and 2 in spring bread wheat Pavon[J].Crop Science, 2003, 43(2): 710-717.

[17]Rabinovich S.Importance of wheat-rye translocations for breeding modern cultivar ofTriticumaestivumL.[J].Euphytica, 1998, 100(1-3): 323-340.

[18]Hsam S, Mohler V, Hartl L, et al.Mapping of powdery mildew and leaf rust resistance genes on the wheat‐rye translocated chromosome 1BL/1RS using molecular and biochemical markers[J].Plant Breeding, 2000, 119(1): 87-89.

[19]Francis H, Leitch A, Koebner R.Conversion of a RAPD-generated PCR product, containing a novel dispersed repetitive element, into a fast and robust assay for the presence of rye chromatin in wheat[J].Theoretical and Applied Genetics, 1995, 90(5): 636-642.

[20]思彬彬, 张超, 徐如宏, 等.小麦基因组DNA改良提取方法的探讨[J].山地农业生物学报, 2005, 24(2): 142-145.

[21]魏琦超, 畅丽萍, 周岩, 等.利用改良CTAB法提取小麦干种子总DNA[J].山西农业科学, 2009, 37(6): 30-32.

[22]马莹莹, 王长有, 吉万全, 等.小麦新种质N95175抗白粉病基因的SSR分析[J].华北农学报, 2008, 23(1): 199-203.

[23]董淑静, 许为钢, 胡琳, 等.43个河南主推小麦品种抗条锈病基因的分子检测[J].华北农学报， 2012, 27(5):157-162.

[24]王凤乐, 吴立人, 徐世昌, 等.绵阳系小麦抗条锈性变异的系统调查[J].植物病理学报, 1996, 26(2): 105-109.

[25]井长勤, 陈荣振, 冯国华.52个重要小麦品种抗条锈基因的推导[J].江苏农业学报, 2005, 21(1): 30-34.

[26]Li Z, Zheng T, He Z, et al.Molecular tagging of stripe rust resistance geneYrZH84 in Chinese wheat line Zhou 8425B[J].Theoretical and Applied Genetics, 2006, 112(6): 1098-1103.

[27]董淑静, 许为钢.小麦条锈病抗性基因研究进展及分子标记辅助聚合育种[J].中国农学通报, 2009, 25(13): 190-196.

[28]庄巧生.中国小麦品种改良及系谱分析[M].北京：中国农业出版社，2003.

[29]周阳, 何中虎, 张改生, 等.1BL/1RS易位系在我国小麦育种中的应用[J].作物学报, 2004, 30(6): 531-535.

MoleculardetectionofYr10andYr18genesand1BL/1RStranslocationinwheatcultivars

Zhang Yuwei1,2,Liu Bo2,Liu Taiguo2,Gao Li2,Chen Wanquan2

(1.YunnanAgriculturalUniversity,Kunming650201,China; 2.StateKeyLaboratoryforBiologyofPlantDiseasesandInsectPests,InstituteofPlantProtection,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193,China)

Using SCAR or STS molecular markers, 75 Chinese commercial wheat cultivars were detected for the existence of stripe rust-resistant genesYr10 andYr18 and 1BL/1RS translocation from 2006 to 2010.The results showed that there were 13 cultivars containingYr10 gene, accounting for 17.3% of the total tested cultivars, only 1 cultivars withYr18, accounting for 1.3%, and 25 cultivars with 1BL/1RS translocation, accounting for 33.3%.Wheat cultivar ‘Xinong 928’ was found to contain bothYr10 andYr18.1BL/1RS translocation, which is resistant to most popular stripe rust races, has been widely used in wheat breeding programs.The slow rust resistance geneYr18 was seldom used in wheat breeding.Therefore, we suggest that the application ofYr18 gene be increased.

wheat; molecular marker; stripe rust resistance gene; 1BL/1RS translocation

2013-04-23

： 2013-05-18

国家科技支撑计划课题(2012BAD19B04);国家“973”计划(2013CB127704);公益性行业(农业)科研专项(200903035);现代农业产业技术体系(CARS-03)；国家自然科学基金项目(31371884)

S 435.121.42

： ADOI： 10.3969/j.issn.0529-1542.2014.01.009

* 通信作者 E-mail:tgliu@ippcaas.cn；wqchen@ippcaas.cn