番茄斑萎病毒YN-1株系GN/GC基因的克隆与分析

孙书娥，李 萌，朱春晖，谭新球，刘 勇,，张德咏,*

(1.湖南农业大学植保学院，长沙 410128；2.湖南省农业科学院植物保护研究所，长沙 410125；3.园艺作物病虫害治理湖南省重点实验室，长沙 410125)

番茄斑萎病毒YN-1株系GN/GC基因的克隆与分析

孙书娥1，李 萌2,3，朱春晖2,3，谭新球2,3，刘 勇1,2,3，张德咏1,2,3*

(1.湖南农业大学植保学院，长沙 410128；2.湖南省农业科学院植物保护研究所，长沙 410125；3.园艺作物病虫害治理湖南省重点实验室，长沙 410125)

作者以TSWV YN-1株系为研究材料，克隆了其GN/GC基因，测序后与GenBank中TSWV其他株系GN/GC基因进行比对，结果显示：YN-1 GN/GC基因全长3 408 bp，编码1 135个氨基酸，构建的系统发育树可分为4个群，YN-1属于群Ⅱ，与源自西班牙的SPAIN-2株系的GN/GC基因核苷酸相似性最高，达98.88%，氨基酸相似性达98.85%。YN-1株系N基因和GN/GC基因的起源不同，我们推断YN-1可能是一个发生重排(reassortment)的新株系，是不同地理起源的株系在共同传播过程中发生了重排的结果，具体原因有待进一步研究。

番茄斑萎病毒; GN/GC基因; 克隆; 分析

番茄斑萎病毒(Tomatospottedwiltvirus，TSWV)是布尼亚病毒科(Bunyaviridae)番茄斑萎病毒属(Tospovirus)的一个典型成员，广泛分布于世界各地[1]，可侵染100多科1 100多种单、双子叶植物，尤其是茄科植物，引起严重的经济损失。其基因组为负单链病毒，包含3个片段，从大到小分别被称为L RNA、M RNA 和S RNA。其中L RNA编码依赖于RNA的RNA复制酶(RdRp)，M RNA为双义RNA，编码运动蛋白(NSm)和高度保守的GN/GC基因。同为双义RNA的S RNA编码核衣壳蛋白(nucleoprotein)和非结构蛋白(NSs)。据报道，GN/GC基因与病毒装配和蓟马传播病毒特性相关[2]。编码核衣壳蛋白的N基因高度保守，常被作为判断株系和血清学反应类型的重要因素[3]。2010年，笔者从云南分离了TSWV YN-1株系，并克隆了N基因(GenBank登录号为：HM694685)，对其进行了序列相似性分析[4]。近年来，TSWV的传播介体——西花蓟马[Frankliniellaoccidentalis(Pergande)]在我国北京、四川、河北、浙江、云南、贵州及山东等地迅速扩散[5-7]，暴发成灾。为了解TSWV的发生流行与西花蓟马传播的关系，本文克隆了YN-1株系的GN/GC基因，分析了其与GenBank中TSWV其他株系GN/GC基因的同源性关系。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

YN-1是作者于2009年从云南番茄上分离鉴定的株系[4]，在矮牵牛上分离，三生烟上繁殖保存。实验室所用Taq酶、反转录酶、PCR纯化回收试剂盒均购自TransGen Biotech公司，pGEM-T easy Vector购自Promega公司，PCR引物由上海生工公司合成，氨苄青霉素购自上海生工公司。其他化学试剂均为国产分析纯试剂。大肠杆菌(E.coli)JM109菌株、矮牵牛、三生烟均由湖南省植物保护研究所分子生物学实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 番茄斑萎病毒的接种与繁殖

TSWV的接种与繁殖参照文献[4]方法进行，在三生烟上繁殖备用。

1.2.2 植物总RNA的提取

采用改进的硅粒吸附法提取叶片总RNA[8]。

1.2.3 cDNA的合成

以提取的RNA为模板用于cDNA的合成，使用TransGen Biotech公司反转录试剂盒。依次加入RNA 5 μL，Random Primer(N9，0.1 μg/μL)1 μL，2×TS Reaction Mix 10 μL，TransScript RT/RI Enzyme Mix 1 μL，加入RNase-free Water 至20 μL；轻轻混匀，25 ℃孵育30 min，42 ℃孵育30 min，然后85 ℃加热5 min失活TransScript RT/RI Enzyme Mix。即得cDNA。

1.2.4 RCR检测

通过比较GenBank中TSWV GN/GC基因的保守序列，设计用于扩增TSWV GN/GC全长序列的引物(表1)。每对引物扩增的片段与邻近片段均重叠100 bp左右。

表1PCR引物序列

Table1ThesequencesofPCRprimers

引物名称Primername引物序列(5′→3′)Primersequence(5′→3′)位置Locationinthecompletesequence退火温度/℃Annealingtemperature扩增片段长度/bpExpectedsizeofPCRproductFG1RG1ATGAGAATTTTAAAACTACTAGAACTAGTGATCGGATAGGGAAATAGATCAACAAAG1～301008～982 521008FG2RG2GAGTTAGAGATTGCATAATCAAATATTCGTCCCTCCTCCTCCTAAAAGAGATTGTTC892～9191927～1898601036FG3RG3CTGGAATGATTGCAGGAGATTCTCCCTTGACCGCATAGAAGACAGCCG1780～18032821～2791601042FG4RG4GATCTGGTTTAGAGCAAATATCAGTCAGACAAGGTGAGAGAAATCCATAG2623～26463408～338250 786

取一0.2 mL PCR薄壁管，依次加入以下试剂：0.25 μL 10×反应缓冲液，0.5 μL 10 mmol/L的dNTP混合物，1 μL 20 μmol/L上游引物，1 μL 20 μmol/L下游引物，1 μL cDNA模板，0.3 μL 5 U/μL的TaqDNA聚合酶，加灭菌ddH2O至终体积为25 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性50 s，退火温度(因引物的Tm值不同而不同)由G1至G4分别为55.4 ℃ 1 min、60 ℃ 1 min、60 ℃ 1 min、50.2 ℃ 1 min，72 ℃延伸1 min，30个循环，最后72 ℃延伸10 min。反应完毕后，从反应液中取5 μL，电泳检查扩增结果。

1.2.5 目的片段的回收

经1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物正确后，用TransGen Biotech公司PCR割胶纯化回收试剂盒回收目的片段。

1.2.6 PCR产物的克隆

回收后的PCR片段与pGEM-T easy Vector 载体经4 ℃过夜连接后，连接产物转化大肠杆菌(E.coli)JM109感受态细胞。37 ℃过夜培养14～16 h后，挑取单菌落进行PCR菌落筛选，选取阳性单菌落在含50 μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中37 ℃，200 r/min的条件下进行培养，对培养菌液提取质粒后，经PCR和酶切鉴定筛选重组质粒。将含目的片段的重组质粒送上海生工公司测序。

1.2.7 序列分析

通过测序所得到的序列经NCBI数据库载体识别程序(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/vecscreen/)去除载体进而得到目的序列，使用DNAStar(Version 5.01)对目的序列进行拼接及格式转换，本文用来构建系统发育树的其他已知株系的GN/GC基因信息均来自GenBank(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)(见表2)，利用MEGA 5进行序列分析。在序列比对过程中，首先用Clustal X进行序列比对分析，然后采用最小进化法的邻接法(neighbour-joining method)构建系统发育树，Bootstrap选择1 000次重复，一般Bootstrap值<70的分支常被认为是不可靠的[9-11]。由于番茄褪绿斑病毒(Tomatochloroticspotvirus，TCSV)在Tospovirus内与TSWV同源关系最接近[12]，所以选用TCSV(GenBank登录号：AY574054)作为本研究构建系统发育树的外群。

表2本文所用TSWV株系的基本信息1)

Table2TheinformationofTSWVisolatesusedinthisstudy

登录号Accessionnumber株系Strain寄主Host地理起源GeographicoriginAB190818///AF208498Regular2A/美国AY744481CA⁃3菊花美国AY744486NC⁃3大丽花美国AY744487NC⁃4烟草美国AY744489NC⁃6辣椒美国AY744492SPAIN⁃1番茄西班牙AY744493SPAIN⁃2番茄西班牙AY744494NC⁃9辣椒美国AY870389T紫背草美国AY870390M紫背草美国FM163370GRAU番茄西班牙FM163372ZO番茄西班牙HM015510Ab1NL2番茄西班牙HM015516D⁃191/澳大利亚HM015521Sala1TL3番茄西班牙HM015522ViTL3番茄西班牙HM581935TomatoNJ⁃JN番茄韩国HM581938Pepper1CY⁃CN辣椒韩国HQ830188p2023WT辣椒意大利JF960236TSWV⁃YN番茄中国JN664253CG⁃1莴苣中国KC261951TSWV⁃5牛繁缕韩国KC261960TSWV⁃8山莴苣韩国KC261966TSWV⁃12莴苣韩国KC261969TSWV⁃16番茄韩国KC261975TSWV⁃18菊花韩国KC294568YN⁃1番茄中国NC002050///AY574054//巴西

1) /：信息不存在Information not available.

2 结果与分析

2.1 RT-PCR结果

采用RT-PCR的方法，设计扩增GN/GC基因的引物，扩增TSWV YN-1株系的GN/GC基因，得到的扩增产物分别为1 008、1 036、1 042和786 bp左右，与预期目的片段大小一致(图1)。

图1 TSWV YN-1 G1、G2、G3和G4的PCR扩增产物Fig.1 The PCR products of TSWV YN-1 G1, G2, G3 and G4

2.2 GN/GC基因的克隆和鉴定

将扩增得到的G1、G2、G3和G4的PCR片段经琼脂糖凝胶电泳割胶回收后，连接至Promega公司pGEM-T easy Vector 上，转化至E.coliJM109感受态细胞中，挑取单菌落进行菌落PCR筛选，通过PCR筛选，获得与预期大小一致的目的条带，所提阳性菌液质粒进行酶切后，也同样得到了与预期大小一致的片段(图2)，所提质粒送北京华大六合基因公司进行测序，测序结果经SeqMan分析后，结果表明TSWV YN-1 GN/GC基因的大小为3 408 bp，GenBank 登录号为KC294568。

2.3 序列同源性分析

所得序列通过与GenBank中TSWV其他株系GN/GC基因比对(图3)，结果显示：TSWV YN-1 GN/GC基因(KC294568)与GenBank中报道的其他株系(表2)GN/GC基因的核苷酸一致率为97.36%，氨基酸一致率为97.95%，建立的系统发育树可分为4个群，在群I的11个成员中，病原分离物来自烟草、辣椒、番茄、菊花和紫背草等寄主植物，寄主的地理起源大多数为美国，仅有2个源自韩国，1个源自西班牙；在群Ⅱ的10个成员中，病原物寄主主要是番茄，1个是牛繁缕，1个是山莴苣，寄主的地理起源多为西班牙，4个源自韩国，仅有1个源自中国即为TSWV YN-1株系，其GN/GC基因(GenBank登录号：KC294568)的同源性与源自西班牙的SPAIN-2株系(GenBank登录号：AY744493)的同源性最高, 核苷酸相似性达98.88%，氨基酸相似性达98.85%；群Ⅲ中仅有2个成员均源自中国，寄主植物分别为莴苣和番茄；在群Ⅳ的6个成员中，寄主和寄主起源各不相同，寄主植物包括莴苣、番茄、辣椒和大丽花等，地理起源有澳大利亚、韩国、西班牙、意大利和美国等。

图2 TSWV YN-1 G1-T、G2-T、G3-T和G4-T质粒酶切产物电泳图Fig.2 The digested products of G1-T, G2-T, G3-T and G4-T of TSWV YN-1

图3 TSWV YN-1(KC294568)与其他株系的GN/GC基因核苷酸系统发育树Fig.3 Phylogenetic relationship between TSWV YN-1 (KC294568) and other isolates based on the GN/GC gene

3 讨论

番茄斑萎病毒由西花蓟马以持久性传播的方式进行自然传播。由于西花蓟马扩散快，寄主范围广，又是TSWV主要的传毒介体，因此西花蓟马的扩散传播导致了部分地区作物上TSWV的暴发流行。在介体传播TSWV过程中，TSWV GN/GC基因编码的糖蛋白起到了至关重要的作用。当病毒粒子通过前肠进入中肠后，中肠上皮细胞膜的一种受体蛋白与TSWV表面的糖蛋白结合，然后进入介体细胞内，再通过一系列的膜屏障进入介体唾液腺[2,13]，最后携带病毒的介体通过取食新的寄主植物从而引起TSWV的传播。本文克隆了TSWV YN-1的GN/GC基因，比较了其与GenBank中30个源自美国、韩国、西班牙等国的代表性株系的亲缘关系，结果表明其与源自西班牙、韩国的株系亲缘关系最近，同属群Ⅱ。因此，YN-1有可能是从西班牙、韩国等地入侵我国的带毒西花蓟马侵染作物后形成的新株系。

我们选择了目前GenBank中TSWV的代表性株系，包括源自美国、韩国等地的30个株系，构建了系统发育树，其可分为4个群。TSWV YN-1 GN/GC基因与源自西班牙的SPAIN-2株系(GenBank登录号：AY744493)的同源性较高，位于群Ⅱ中。2010年，我们克隆了TSWV YN-1 N基因的全长序列并进行了同源性分析，发现YN-1 N基因与韩国3个株系的同源性较高[3]。YN-1株系N基因和GN/GC基因同源性分析属于不同的群，说明它们的起源不同，我们推断YN-1可能是一个重排(reassortment)的新株系，是不同地理起源的株系在共同传播过程中发生了重排的结果，具体原因有待进一步研究。

[1] Best R J.Tomatospottedwiltvirus[J].Advances in Virus Research, 1968,13:65-146.

[2] Whitfield A E, Ullman D E, German T L.Tospovirus-thrips interactions[J].Annual Review of Phytopathology,2005,43:459-489.

[3] Goldbach R, Kuo G.Introduction: proceedings of the international symposium on tospovirus and thrips of floral and vegetable crops[J].Acta Horticulturae,1996, 431:21-26.

[4] 唐前君,孙书娥,刘勇,等.番茄斑萎病毒核衣壳蛋白基因的克隆与分析[J].植物保护,2010,36(5):65-69.

[5] 张友军,吴青君,徐宝云，等.危险性外来入侵生物——西花蓟马在北京发生危害[J].植物保护,2003,29(4):58-59.

[6] 徐家菊,韦丽莉.临沧市新发现外来有害生物——西花蓟马[J].植物检疫, 2005,19(5):294-295.

[7] 郑长英,刘云虹,张乃芹,等.山东省发现外来有害生物——西花蓟马[J].青岛农业大学学报(自然科学版), 2007,24(3):172-174.

[8] 张德咏,谭新球,罗源华,等.用单管逆转录-聚合酶链式反应检测辣椒黄瓜花叶病毒[C]∥成卓敏.农业生物灾害预防与控制研究.北京:中国农业科技出版社,2005:282-287.

[9] Efron B, Halloran E, Holmes S.Bootstrap confidence levels for phylogenetic trees[J].Proceedings of the National Academy of Sciences USA,1996,93: 7085-7090.

[10]Hillis D M, Bull J J.An empirical test of bootstrapping as a method for assessing confidence in phylogenetic analysis[J].Systematic Biology,1993,42:182-192.

[11]Kumar S, Stecher G, Peterson D, et al.MEGA-CC: computing core of molecular evolutionary genetics analysis program for automated and iterative data analysis[J].Bioinformatics,2012, 28:2685-2686.

[12]Tentchev D, Verdin E, Marchal C, et al.Evolution and structure ofTomatospottedwiltviruspopulations: evidence of extensive reassortment and insights into emergence processes[J].Journal of General Virology, 2011,92:961-973.

[13]武晓云,程晓非,张宏瑞,等.西花蓟马(Frankliniellaoccidentalis)研究进展[J].云南农业大学学报,2006,21(2):178-183.

CloningandsequenceanalysisoftheGN/GCgeneofTomatospottedwiltvirusYN-1

Sun Shue1,Li Meng2,3,Zhu Chunhui2,3,Tan Xinqiu2,3,Liu Yong1,2,3,Zhang Deyong1,2,3

(1.CollegeofPlantProtection,HunanAgriculturalUniversity,Changsha410128,China; 2.InstituteofPlantProtection,HunanAcademyofAgriculturalSciences,Changsha410125,China; 3.KeyLaboratoryofIntegratedManagementofthePestsandDiseasesonHorticulturalCropsinHunanProvince,Changsha410125,China)

In this study, we cloned the complete nucleotide sequence of GN/GCgene of TSWV YN-1 strain, and analyzed its phylogenetic relationship to other TSWV isolates from GenBank.The results showed that the complete nucleotide sequence of GN/GCgene was 3 408 nt and encoded 1 135 aa, and the phylogenetic tree of the complete nucleotide sequence of the GN/GCgene of TSWV isolated from different hosts in different geographic origins in the world, divided into four groups, were constructed, where TSWV YN-1 was in group Ⅱ, and the complete nucleotide and amino acid sequences of GN/GCexhibited 98.88% and 98.85% identity with SPAIN-2 (accession number: AY744493) isolated from tomato in Spain, respectively.Because the origins of N gene and GN/GCgene of TSWV YN-1 were different, we inferred that TSWV YN-1 might be a new strain, resulted from a reassortment event happened in co-transmission between different strains of geographic origins.The mechanism needs to be studied further.

Tomatospottedwiltvirus; GN/GCgene; clone; analysis

2013-08-29

： 2013-10-11

国家自然科学基金(31171816，30871619);国家公益性行业(农业)科研专项(201303028);湖南省应用基础研究计划重点项目(2012FJ2009)

S 432.41

： ADOI： 10.3969/j.issn.0529-1542.2014.01.011

* 通信作者