异草松降解酶在不同条件下降解效果的比较研究

刘亚光，刘 冰，李晓雨，李 威，井秋月，何付丽

(东北农业大学农学院，哈尔滨 150030)

刘亚光*，刘 冰，李晓雨，李 威，井秋月，何付丽

(东北农业大学农学院，哈尔滨 150030)

为了验证异噁草松高效降解菌W2的降解效果，应用气相色谱法检测异噁草松含量，考察了在室内条件下不同培养温度、土壤湿度、原酶液添加量和异噁草松初始添加浓度对酶液降解异噁草松的影响。结果表明：在培养温度为30 ℃、土壤湿度为田间最大持水量的50%、原酶液添加量为2 mL/kg且酶活力为1.066 μg/mL·min的条件下，30 d降解酶对异噁草松的降解率最高，达到81.7%，与添加菌悬液处理和药剂对照相比分别提高了31.0%和58.5%，降解半衰期(12.3 d)比菌悬液和药剂对照分别缩短了16.9 d和68.3 d，而异噁草松初始添加浓度对降解酶的降解效果影响差异不显著。

异噁草松； 降解酶； 降解效果

异噁草松(clomazone)主要作为苗前或苗后选择性除草剂防除一年生禾本科杂草和阔叶杂草[1-2]，但在土壤中不易分解。大多数农药的降解是通过微生物分泌的降解酶与底物发生酶促反应而完成的[3-4]，异噁草松在土壤中降解也主要依靠微生物活动[5-6]，由此可见利用微生物降解残留除草剂，是一种安全有效并切实可行的途径。鉴于微生物对异噁草松降解的实质是酶促反应[7]，本课题组从降解酶的角度探索异噁草松的微生物降解问题，并展开深入研究，已成功筛选出异噁草松高效降解菌W2[8]，并对影响降解菌W2生物修复效果的因素进行了研究[9]，探明了W2的最佳发酵培养基[10]，及其有效酶成分在细胞中的位置和降解酶的酶学性质[11]，本文考察不同条件对降解酶降解异噁草松的影响，是在前者研究的基础上进一步深入。

本研究采用气相色谱法检测异噁草松的含量[12-14]，考察了室内条件下不同培养温度、土壤湿度、原酶液添加量和异噁草松初始添加浓度对酶液降解异噁草松的影响，系统地研究了异噁草松降解酶在不同条件下的降解效果，为降解菌酶在实际生产中用于解决异噁草松的残留危害问题提供理论依据和技术支持。目前酶固定化技术正在得到广泛的研究与开展[15-17]，本研究得出降解酶的最适反应条件，为酶的固定化生产奠定一定的基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试药品：99.0%异噁草松标准品，哈尔滨利民农化有限公司提供。

供试仪器：气相色谱仪GC-2010，日本岛津公司。

供试菌种：异噁草松高效降解菌：由东北农业大学杂草与农药实验室提供，筛选自东北农业大学香坊农场长期施用过长残效除草剂异噁草松的地块，菌株编号为W2(短杆菌属Brevibacterium)[8]。

1.2 试验方法

1.2.1 降解条件对降解酶降解异噁草松影响的研究

1.2.1.1降解酶液的制备

采用摇瓶培养法对异噁草松降解菌W2进行培养，培养基配方为：乳糖2%，酵母浸提液2%，CaCl20.6%，KCl 0.4%，ZnSO40.02%，K2HPO40.015%，异噁草松100 μg/L；培养条件为：种龄38 h，摇瓶装液量50 mL/250 mL，接种量2.5%，初始pH7.0，培养温度为30 ℃，摇床转速150 r/min；产酶终点时间为48 h。收集菌体，按照每1 g样品加3 mL缓冲液的比例将菌体悬浮于缓冲溶液中，冰浴下应用功率为350 W的超声波破碎仪破碎20次，每次6 s，间隔8 s，然后7 000 r/min离心10 min，上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，收集得胞内粗酶液。酶液为现配现用，酶活力为1.066 μg/mL·min。

1.2.1.2温度对降解酶降解效果的影响

于自然风干的25 g土壤中添加初始浓度为5 mg/L的异噁草松溶液，调节土壤湿度为田间最大持水量的50%，用喷雾器向土壤中均匀喷洒原酶液，并边喷洒边搅拌，使酶液在土壤中均匀分布，且含量为2 mL/kg，设3次重复。将处理后的土壤装入洁净的培养皿中，并盖好皿盖，记录总重量，每2 d称量，加水补足，以保持土壤的含水量不变。于20、25、30 ℃恒温培养箱中放置，分别于0、1、3、5、10、15、20、30 d后检测异噁草松含量，计算异噁草松降解率和半衰期。以添加相同浓度菌悬液的异噁草松土壤作为菌悬液处理，以不添加粗酶液和菌悬液的异噁草松土壤作为药剂对照。

1.2.1.3土壤湿度对降解酶降解效果的影响

调节供试土壤的含水量为田间最大持水量的37.5%、50%和62.5%，于25 g自然风干的土壤中添加异噁草松，使其初始浓度为5 mg/L，并添加原酶液，处理如1.2.1.2。于30 ℃条件下分别放置0、1、3、5、10、15、20、30 d后，应用气相仪检测异噁草松含量，计算异噁草松降解率和半衰期。以添加相同浓度菌悬液的异噁草松土壤作为菌悬液处理，以不添加粗酶液和菌悬液的异噁草松土壤作为药剂对照。

1.2.1.4酶液添加量对降解酶降解效果的影响

在土壤中添加原酶液，使酶液在土壤中含量分别为1、2和4 mL/kg，土壤湿度为田间最大持水量的50%，异噁草松在土壤中的初始浓度为5 mg/L，设3次重复，每2 d加水补足，在30 ℃下放置，分别于0、1、3、5、10、15、20、30 d后检测异噁草松含量，计算异噁草松降解率和半衰期。以添加相同浓度菌悬液的异噁草松土壤作为菌悬液处理，以不添加粗酶液和菌悬液的异噁草松土壤作为药剂对照。

1.2.1.5异噁草松浓度对降解酶降解效果的影响

使异噁草松在土壤中的初始添加浓度分别为10、5和2.5 mg/L，土壤湿度为田间最大持水量的50%，设3次重复，每2 d加水补足。在30 ℃的条件下，向土壤中添加原酶液，使酶液在土壤中含量为2 mL/kg，分别于0、1、3、5、10、15、20、30 d后检测异噁草松含量，计算异噁草松降解率和半衰期。以添加相同浓度菌悬液的异噁草松土壤作为菌悬液处理，以不添加粗酶液和菌悬液的异噁草松土壤作为药剂对照。

1.2.1.6异噁草松降解率计算公式

1.2.1.7异噁草松降解动力学方程

降解菌酶降解异噁草松动力学方程采用一级动力学方程拟合：Ct=C0·e-kt(Ct：t时刻异噁草松残留浓度，C0：异噁草松初始浓度，k：降解菌酶降解速率常数)。

1.2.2 气相色谱法检测异噁草松含量

1.2.2.1气相色谱分析条件

色谱柱：RTX-1701石英毛细管柱，30 m×0.25 mm×0.25 μm；进样口温度：200 ℃；柱温：起始温度200 ℃，保持4 min，以10 ℃/min升温至220 ℃，保持4 min；进样量：1.0 μL；检测器温度：ECD检测器，280 ℃；分流比：3.0；保留时间：10 min。

1.2.2.2异噁草松标准曲线的制备

称取10 mg异噁草松标准品溶于100 mL容量瓶中，用甲醇定容，即为100 mg/L的母液。用移液枪分别取0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10 mL用甲醇定容至100 mL，配制成浓度为0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10 mg/L的标准溶液。用气相色谱仪按上述色谱条件进样，测定各处理。异噁草松在0.01～10 mg/L浓度范围内呈良好的线性关系，回归方程为y=80 608x-4 788.3，决定系数R2=0.997 3。

1.2.2.3土壤中样品前处理方法

将土壤样品装入三角瓶中，每克样品中加入3 mL乙酸乙酯-丙酮V乙酸乙酯∶V丙酮=9∶1混合溶剂，在振荡器上振荡2 h，抽滤提取，将提取液转移到圆底烧瓶中，通过旋转蒸发仪蒸发至1 mL，于室温下用氮气吹干仪吹干，无水硫酸铜脱水，用5 mL甲醇溶解残渣，过0.22 μm滤膜，待GC-ECD分析。

1.2.2.4土壤中异噁草松检测体系的添加回收率

配制异噁草松标准品浓度为0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、5.0 mg/L，混入自然风干的土壤中，调节土壤湿度为田间最大持水量的50%，按1.2.2.3所述前处理方法进行处理后，用气相色谱检测异噁草松含量，计算该方法的添加回收率。

1.2.3 数据分析方法

试验原始数据经Excel软件处理完成，并应用DPS软件对试验数据进行方差分析，差异显著性比较采用Duncan新复极差法。

2 结果与分析

2.1 不同条件对异噁草松降解酶降解效果的影响

2.1.1 土壤中异噁草松检测体系的添加回收率

如表1所示，异噁草松的添加回收率在81.5%～94.3%之间，变异系数为1.7%～6.7%，符合国家农药残留试验准则(NY/T 788-2004)[18]要求。说明土壤中样品前处理方法可行。

表1土壤中异噁草松添加回收率和相对标准偏差

Table1Fortifiedrecoveryandrelativedeviationofclomazonefromsoils

添加浓度/mg·L-1Addedconcentration回收率/%Recoveryrate12345平均回收率/%Averagerecovery相对标准偏差/%Relativestandarddeviation0．0191．983．476．874．780．681．56．70．0582．691．084．175．280．182．65．80．184．077．683．085．690．284．14．60．580．584．589．189．389．086．53．9193．088．889．892．983．489．63．9593．795．693．392．596．594．31．7

2.1.2 温度对降解酶降解效果的影响

由图1可知，随着处理时间的延长，降解粗酶液对异噁草松的降解率逐渐增大，随着温度的增加，降解酶降解异噁草松的速度明显提高，且差异显著，温度为25 ℃和30 ℃的降解效果好，且降解率的变化趋于一致。在试验所设定温度范围内，30 ℃条件下降解率最高，在第30天时可达到81.7%，与20 ℃低温相比高出11.7%，而只比25 ℃的处理高出2.7%，说明温度对降解酶的降解效果有显著的影响。

通过对异噁草松残留量的数据分析，计算得到不同温度下的降解动力学方程及各项参数，如表2所示。由表2可知，温度为30 ℃的处理下降解半衰期最短，仅为12.3 d，与20 ℃处理相比半衰期提高了4.2 d，而仅比25 ℃处理提前了1.4 d，因此推测在本试验条件下降解酶的最适降解温度为30 ℃。

图1 温度对降解酶降解效果的影响Fig.1 Effects of temperature on degradation by the enzyme

表2 不同温度下降解酶降解异噁草松的动力学参数1)Table 2 Kinetic parameters of the biodegradation of clomazone by the enzyme at different temperatures

1)**表示相关性极显著。 ** Indicates highly significant correlation.

2.1.3 土壤湿度对降解酶降解效果的影响

由图2可知，在土壤湿度为50%时，降解酶对异噁草松的降解率明显高于37.5%和62.5%条件下。在这3种条件下，降解率的变化趋于一致，均随着时间的延长而增大，且差异显著，并且第5 天降解率增加幅度最大，说明降解酶在添加5 d内降解能力最强。在试验所设定条件范围内，土壤湿度为50%时降解率最高，在第30 天时可达到81.2%，与37.5%和62.5%条件下相比分别高出11.2%和9.7%，说明土壤湿度对降解酶的降解效果有显著的影响。

通过对异噁草松残留量的数据分析，计算得到不同土壤湿度下的降解动力学方程及各项参数，如表3所示。由表3可知，土壤湿度为50%的处理下降解半衰期最短，仅为12.7 d，比37.5%和62.5%半衰期分别缩短了4.5 d和3.7 d，说明调节土壤湿度为50%时可以提高土壤中异噁草松的降解效果，缩短降解时间，即异噁草松降解酶的适宜降解土壤湿度为50%。

图2 土壤湿度对降解酶降解效果的影响Fig.2 Effects of soil moisture on degradation by the enzyme

表3不同土壤湿度下降解酶降解异噁草松的动力学参数1)

Table3Kineticparametersofthebiodegradationofclomazonebytheenzymeunderdifferentsoilmoistureconditions

土壤湿度/%Soilmoisture回归方程Regressionequation(Ct=C0e-kt)决定系数(R2)Determinationcoefficient速率常数(k)Rateconstant半衰期(T1/2)/dHalf⁃life37．5Ct=4．6775e-0．0404t0．9791∗∗0．040417．250．0Ct=4．1311e-0．0545t0．9523∗∗0．054512．762．5Ct=4．4662e-0．0422t0．9585∗∗0．042216．4

1) **表示相关性极显著。 ** Indicates highly significant correlation.

2.1.4 酶液添加量对降解酶降解效果的影响

由图3可知，降解酶对异噁草松的降解率随着时间的延长而增大，且差异显著。随着降解酶添加量的增加，降解酶对异噁草松的降解速度明显提高，添加量为2～4 mL/kg的降解效果好，并且降解率的变化趋于一致。在试验所设定条件范围内，酶液添加量为4 mL/kg时降解率最高，在第30天时可达到81.5%，与1 mL/kg的低添加量相比高出11.4%，而只比2 mL/kg的添加量高出1.4%，说明酶液添加量对降解酶的降解效果有显著的影响，当添加量大于2 mL/kg时降解效果提高不明显。

图3 酶液添加量对降解酶降解效果的影响Fig.3 Effects of enzyme addition on degradation by the enzyme

通过对异噁草松残留量的数据分析，计算得到不同酶液添加量条件下的降解动力学方程及各项参数，如表4所示。从表4可知，添加量为4 mL/kg的处理下降解半衰期最短，仅为12.9 d，与1 mL/kg处理相比半衰期提高了3.9 d，而仅比2 mL/kg处理提前了0.3 d，说明适当提高酶液添加量有缩短降解时间的效果，考虑到实际应用成本的问题，则应该在保证降解效果的同时选择适当的添加量，因此在本试验条件下异噁草松降解酶的适宜添加量为2 mL/kg。

表4不同酶液添加量下降解酶降解异噁草松的动力学参数1)

Table4Kineticparametersofthebiodegradationofclomazonebytheenzymeatdifferentenzymeadditiontreatments

酶液添加量/mL·kg-1Enzymeaddition回归方程Regressionequation(Ct=C0e-kt)决定系数(R2)Determinationcoefficient速率常数(k)Rateconstant半衰期/dHalf⁃life(T1/2)1Ct=4．7322e-0．0412t0．9827∗∗0．041216．82Ct=4．1310e-0．0524t0．9516∗∗0．052413．24Ct=4．0634e-0．0539t0．9565∗∗0．053912．9

1) **表示相关性极显著。 ** Indicates highly significant correlation.

2.1.5 异噁草松浓度对降解酶降解效果的影响

由图4可知，降解酶对异噁草松的降解率随着时间的延长而增大，且差异显著，随着异噁草松初始添加浓度的增加，降解酶对异噁草松的降解速度提高，在这3种条件下，降解率的变化趋于一致，均于第5天降解率增加幅度最大，说明降解酶在添加5 d内降解能力最强。在试验所设定条件范围内，异噁草松初始添加浓度为10 mg/L时降解率最高，在第30天时可达到84.9%，与2.5 mg/L和5 mg/L的处理相比分别高出5.9%和4.4%，说明异噁草松初始添加浓度对降解酶的降解效果影响差异不显著。

通过对异噁草松残留量的数据分析，计算得到不同异噁草松初始添加浓度条件下的降解动力学方程及各项参数，如表5所示。如表5可知，添加量为10 mg/L的处理下降解半衰期最短，仅为11.2 d，分别只比2.5 mg/L和5 mg/L处理的半衰期缩短了2.0 d和1.8 d，说明异噁草松浓度高对降解酶的降解效果影响差异不显著。

图4 异噁草松浓度对降解酶降解效果的影响Fig.4 Effects of clomazone concentration on degradation by the enzyme

表5不同异噁草松浓度下降解酶降解异噁草松的动力学参数1)

Table5Kineticparametersofthebiodegradationofclomazonebytheenzymeatdifferentclomazoneconcentrations

异噁草松浓度/mg·L-1Clomazoneconcentration回归方程Regressionequation(Ct=C0e-kt)决定系数(R2)Determinationcoefficient速率常数(k)Rateconstant半衰期/dHalf⁃life(T1/2)2．5Ct=2．2827e-0．0524t0．9750∗∗0．052413．25Ct=4．1332e-0．0532t0．9503∗∗0．053213．010Ct=8．0166e-0．0619t0．9507∗∗0．061911．2

1) **表示相关性极显著。 ** Indicates highly significant correlation.

2.1.6 异噁草松降解酶降解效果的研究

由图5可知，降解酶和W2菌悬液的降解率随着处理时间的增加而提高，但W2菌悬液和药剂对照在5 d内差异不显著, 可能是由于菌生长繁殖较慢，分泌降解酶较少。添加降解酶和W2菌悬液后，异噁草松的降解速度明显提高，30 d降解率远远高于自然降解，其中降解酶的降解能力优于菌悬液降解能力。降解酶在降解30 d后降解率可达到81.7%，此时土壤中残留浓度仅为0.916 mg/L，降解率与药剂自然降解率相比增加了58.5%，比W2菌悬液的提高了31.0%。

通过对异噁草松残留量的数据分析，计算得到降解酶、W2菌悬液和药剂对照的降解动力学方程及各项参数，如表6所示。从表6可知，药剂对照和W2菌悬液处理降解半衰期分别为80.6 d和29.2 d，降解酶的降解半衰期与药剂对照和菌悬液相比分别提前了68.3 d和16.9 d，说明添加降解酶可以明显提高土壤中异噁草松的降解速率。

图5 降解酶对异噁草松的降解曲线Fig.5 Clomazone degradation curve by the enzyme

表6 降解酶对异噁草松的降解动力学参数1)Table 6 Kinetic parameters of the biodegradation of clomazone by the enzyme

1) **表示相关性极显著。 ** Indicate highly significant correlation.

3 结论与讨论

本研究结果表明，培养温度为30 ℃，土壤湿度为田间最大持水量的50%，原酶液(酶活力为1.066 μg/mL/min)添加量为2 mL/kg的条件下，30 d降解酶对异噁草松的降解率最大，为81.7%，与添加菌悬液处理和药剂对照相比分别提高了31.0%和58.5%，降解半衰期(12.3 d)比菌悬液和药剂对照分别缩短了16.9 d和68.3 d。异噁草松初始添加浓度对降解酶的降解效果影响差异不显著。

在实验室内异噁草松降解酶的最适温度为35 ℃，但因为东北地区夏天土壤表层温度一般集中于30 ℃左右，而随着土壤深度的增加温度还会逐渐降低，故本研究土壤温度范围仅设置为20～30 ℃，其中30 ℃时降解酶的降解效果最好，可以为降解酶的田间实际应用提供理论数据。

除此之外，影响酶对农药生物修复的因素还有农药本身。本研究结果表明，当异噁草松浓度为2.5、5、10 mg/L时，降解酶对其降解效果影响差异不显著，但是这并不能完全反映底物浓度对异噁草松降解酶降解效果的影响，还应该对高浓度或更低浓度的底物进行酶降解试验，从而获得更准确的反应趋势。

本研究在最适反应条件下研究降解酶对异噁草松的降解作用。结果表明，5 d时降解率可达到42.0%，但是随着时间的延长降解速度增加幅度减慢，说明降解酶活力逐渐降低，30 d时降解率为81.7%，显著高于W2菌肥最适降解条件下的55.0%，直接应用酶液仅可在短时间内提高降解率。酶的性质不稳定，容易受到在环境中移动性差、被土壤吸附、微生物的蛋白酶降解等因素的影响而降低或失去活性，酶的固定化则可以很好地解决这个难题，即通过化学或物理方法将游离态酶固定在载体上，使其成为具有活力的、可重复使用的生物活性物[19-20]。但是将其固定化后，所用固定化试剂可能会阻碍底物与内部有效降解成分的接触，使降解酶的活力降低[21]。

本研究结果表明，异噁草松降解酶能够快速高效地降解异噁草松，并且对酶促反应的环境条件要求低，如果能够提高降解酶的稳定性，在农药污染的生物修复与治理方面将有更宽广的前景。

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Comparativestudiesonthedegradationeffectsoftheclomazonedegradationenzymeunderdifferentconditions

Liu Yaguang,Liu Bing,Li Xiaoyu,Li Wei,Jing Qiuyue,He Fuli

(CollegeofAgriculture,NortheastAgriculturalUniversity,Harbin150030,China)

To validate the high efficiency of clomazone degradation by the bacterium W2, this study employed gas chromatography to determine the amount of clomazone.To determine the effects of the clomazone-degrading enzyme, four factors were studied, involving the temperature, the soil moisture, enzyme addition and clomazone concentration under indoor conditions.The results showed that the best degradation rate of clomazone was 81.7% after 30 d at 30 ℃, 50% of soil water content, 2 mL/kg enzyme and 1.066 μg/mL·min of enzyme activity, which was 31.0% and 58.5% higher than those of bacterial and reagent treatments, while the degradation half-life was 12.3 d, shortened by 16.9 d and 68.3 d, respectively.There were no significant effects at different clomazone concentrations on clomazone degradation by the enzyme.

clomazone; degradation enzyme; degradation effect

2013-04-24

： 2013-09-16

X 172, X 592

： ADOI： 10.3969/j.issn.0529-1542.2014.01.016

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