不同Bt蛋白对棉铃虫存活率和生长发育的影响

路献勇， 张 帅， 吕丽敏， 雒珺瑜， 王春义， 崔金杰

中国农业科学院棉花研究所，棉花生物学国家重点实验室，河南 安阳 455000

自1990年国外首次用农杆菌介导法获得Cry1Ab、Cry1Ac转基因棉花植株以来(Perlaketal.,1990)，编码Cry1Ac蛋白的基因已成功应用于植物基因工程，并培育出了转基因抗虫棉用于大规模生产。中国研究人员也于1993年将Cry1Ac基因导入到中国主产棉区的数个栽培品种中，获得了第1代单价抗虫棉(郭三堆等，1999)。目前中国主要以种植转单价Bt基因的抗虫棉花为主，由于转入的Bt基因类型单一，长期种植容易导致棉铃虫HelicoverpaarmigeraHübner对Cry1Ac基因的抗性增加，因此，为了延缓靶标害虫对Cry1Ac蛋白的抗性，培育叠加基因的抗虫棉花品种受到广泛重视。目前，转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉已在美国、澳大利亚、墨西哥等国家商业化种植，我国也培育出了转双价基因Cry1Ac+Cry2Ab的抗虫棉(雒珺瑜等，2011)。为了揭示不同Bt蛋白的抗虫效果，本文研究了Cry1Ac、Cry1Ab、Cry2Ab、Cry1Ah、Cry2Aa和Cry1Ca 6种Bt蛋白对棉铃虫幼虫室内种群存活率、体重和生长发育的影响，期望为新一代转基因抗虫棉花的培育提供依据，为新型转基因棉花材料的抗虫性鉴定和安全评价提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试棉铃虫

室内敏感品系：2005年6月采自河南省安阳县白壁镇中国农业科学院棉花研究所棉田第2代，在室内不用任何药剂处理，连续用人工饲料饲养70代。

1.2 供试Bt蛋白

Cry1Ac、Cry1Ab、Cry2Ab、Cry1Ah、Cry2Aa和Cry1Ca 6种Bt蛋白均由中国农业科学院植物保护研究所中保科农公司(北京)提供。

1.3 棉铃虫人工饲料

采用卓乐姒等(1981)的棉铃虫人工饲料配方经稍微改进。人工饲料配方如下：黄豆粉200 g，玉米粉300 g，小麦粉300 g，抗坏血酸10 g，酵母粉80 g，甲醛10 mL，36%乙酸60 mL，苯甲酸钠9 g，琼脂35 g，水2000 mL。成虫期饲喂10%的蜂蜜水。养虫室每月用紫外灯消毒1次，棉铃虫蛹用甲醛消毒15 min，以防止棉铃虫遭受核角体病毒的侵染。

在配制饲料过程中，当饲料内的温度降到55～60 ℃时，取不同浓度的Bt蛋白分别加到不同处理的人工饲料中，每个处理的饲料量为100 g；用搅棒迅速搅匀，待饲料凝固后放入4 ℃冰箱备用。使用前切成1 g左右的块状，分别放入24孔培养板中用于饲养棉铃虫幼虫，培养板表面覆盖白布以防止幼虫逃逸。

1.4 生物测定方法

1.4.1 不同Bt蛋白对棉铃虫初孵幼虫的毒力测定 测定包括预备试验和正式试验2个部分。预备试验共设置5个质量浓度梯度，将供试幼虫的死亡率控制在10%～90%范围内；其中Cry1Ab、Cry1Ac和Cry2Ab的浓度梯度为1.0、0.5、0.1、0.01和0.001 μg·g-1；Cry1Ah、Cry2Aa和Cry1Ca的质量浓度梯度为20.0、5.0、2.0、1.0和0.5 μg·g-1。正式试验共设置7个浓度梯度，其中Cry1Ac、Cry1Ab和Cry2Ab的浓度梯度为1.0、0.5、0.2、0.1、0.05、0.01和0.001 μg·g-1；Cry1Ah、Cry2Aa和Cry1Ca的浓度梯度为20.0、10.0、5.0、2.5、1.25、0.625和0.3125 μg·g-1。均用5 mL的Na2CO3溶液作为对照。

毒力测定前先用pH 9.5的Na2CO3溶液对毒蛋白进行稀释，然后将稀释后的Bt毒蛋白混入饲料中(Beegleetal.,1990)。测定时在饲料中接入孵化后1日龄幼虫(24 h±2 h)，在温度(27±1) ℃、湿度(75±5)%、光周期(光照/黑暗)14/10以及合适的光强条件下饲养。每处理24头幼虫，重复6次。饲养7 d后记录幼虫存活数，计算校正死亡率。用SPSS 19.0软件进行Probit回归分析，计算LC50值(贾春生，2006)。

1.4.2 不同Bt蛋白对棉铃虫幼虫生长发育的影响 配制饲料前用pH 9.5的Na2CO3溶液分别将6种蛋白稀释成100 μg·mL-1，配制饲料时取稀释好的Bt蛋白溶液5 mL混入100 g饲料，使其在饲料中的浓度为1.0 μg·g-1，对照仅混入5 mL的Na2CO3。

测定设初孵幼虫、1龄幼虫和2龄幼虫3组试验。每组试验设6种Bt蛋白和对照共7个处理，每处理32头幼虫，重复3次。测定时在饲料中接入幼虫，放置在与1.4.1相同的条件下饲养。初孵幼虫和1龄幼虫饲养7 d后，分别记录幼虫死亡率，并用电子天平(精确到0.00001 g)称取所有活虫体重，计算体重抑制率。

体重抑制率(%)=(对照组平均体重-处理后平均体重)/对照组平均体重×100。

2龄幼虫饲养3、5、7和9 d后分别称取幼虫体重，每天记录幼虫发育天数、化蛹数、蛹重、蛹期天数和羽化数，直至羽化完成。试验数据用SAS 8.1软件分析。

2 结果与分析

2.1 不同Bt蛋白对棉铃虫初孵幼虫的毒力测定

由表1可知，不同Bt蛋白对棉铃虫的毒力效应不同，用Bt蛋白连续饲喂7 d后的致死中浓度(LC50)依次为Cry1Ab>Cry1Ac>Cry2Ab>Cry2Aa>Cry1Ah。

表1 不同Bt蛋白处理的棉铃虫初孵幼虫的致死中浓度(LC50)和线性回归方程参数Table 1 Mean lethal concentrations (LC50)and probit regression line parameters of Bt proteins against the newly hatched larvae of cotton bollworm (H.armigera)

2.2 不同Bt蛋白对棉铃虫低龄幼虫校正死亡率和体重抑制率的影响

棉铃虫初孵幼虫和1龄幼虫取食含不同Bt蛋白饲料7 d后，不同处理间的校正死亡率有极显著差异(初孵幼虫，df=5，F=341.81，P<0.0001；1龄幼虫，df=5，F=329.02，P<0.0001)。不同处理间的体重抑制率也有极显著差异(初孵幼虫，df=5，F=337.50，P<0.0001；1龄幼虫，df=5，F=57.84，P<0.0001)。Cry1Ac和Cry1Ab蛋白对棉铃虫初孵幼虫的校正死亡率极显著高于Cry2Ab蛋白，与Cry2Ab蛋白相比，Cry1Ah和Cry2Aa蛋白处理的棉铃虫初孵幼虫的校正死亡率显著降低，Cry1Ca处理下，初孵幼虫死亡率极显著低于另外5种蛋白。而对于1龄棉铃虫则略有不同，Cry1Ab蛋白显著高于其余5种蛋白，Cry1Ac和Cry2Ab蛋白极显著高于Cry1Ah、Cry2Aa和Cry1Ca，而Cry1Ah蛋白极显著高于Cry2Aa，Cry1Ca蛋白极显著低于Cry2Aa。Cry1Ac、Cry1Ab和Cry2Ab处理的初孵幼虫体重抑制率极显著高于Cry1Ah和Cry2Aa蛋白处理，而Cry1Ca处理下的棉铃虫体重抑制率则极显著低于Cry1Ah和Cry2Aa蛋白；6种蛋白处理的1龄幼虫的体重抑制率的多重比较结果与初孵幼虫相同(图1)。

2.3 不同Bt蛋白处理棉铃虫2龄幼虫后的体重变化

棉铃虫2龄幼虫取食含不同Bt蛋白的饲料后，不同处理间幼虫体重有极显著性差异(1 d，df=6，F=175.29，P<0.0001；3 d，df=6，F=94.77，P<0.0001；7 d,df=6，F=66.42，P<0.0001；9 d，df=6，F=924.33，P<0.0001)。多重比较结果表明，对照和Cry1Ca处理之间棉铃虫的体重在1、3、7和9 d均没有显著差异；Cry1Ac、Cry1Ab处理下的2龄幼虫仅在9 d后体重极显著高于Cry2Ab蛋白；而Cry1Ah处理下的幼虫体重仅在7 d后显著低于Cry2Aa，而在1、3和9 d后均是极显著低于该蛋白。与Cry2Ab相比，Cry1Ah处理下的幼虫体重仅在1 d后极显著增加，其他时间段均没有显著差异(表2)。

2.4 不同Bt蛋白处理棉铃虫2龄幼虫后的生物学参数差异

棉铃虫2龄幼虫取食含不同Bt蛋白的饲料后，不同处理间除了蛹期显著差异外，其他生物学参数均为极显著差异(11 d后幼虫死亡率，df=6，F=9.47，P=0.0006<0.001；幼虫发育历期，df=4，F=183.54，P<0.0001；化蛹率，df=6，F=97.92，P<0.0001；蛹重，df=6，F=27.92，P<0.001；蛹期，df=4，F=6.41，P=0.0129<0.05；羽化率，df=6，F=107.37，P<0.0001)。Cry1Ac和Cry1Ab蛋白处理下11 d后棉铃虫的死亡率显著高于其他4种蛋白，差异不显著。用Cry1Ac和Cry1Ab蛋白处理的棉铃虫无法完成整个幼虫发育历期，而用Cry1Ah、Cry2Aa、Cry2Ab、Cry1Ca和对照处理的棉铃虫幼虫发育历期均有显著差异，幼虫发育历期的顺序为CK

图1 1.0 μg·g-1不同Cry蛋白对棉铃虫初孵幼虫和1龄幼虫校正死亡率和体重抑制率的影响Fig.1 Abbott-corrected mortality rates and weight inhibition rates caused by active Cry proteins against the newly hatched and first-instar larvae of cotton bollworm (H.armigera) fed with 1.0 μg of toxin /g food图中数据为平均数±标准误；柱子上不同字母表示数据经Duncan氏法多重比较差异显著，大写字母表示差异极显著(P<0.01),小写字母表示差异显著(P<0.05)。The data in the figure are mean±SE, and bars with the different letters above are significantly different by Duncan′s multiple ranging test. Capital letters show highly extremely significant differences (P<0.01), and small letters, show significant differences (P<0.05).

处理Treatment棉铃虫幼虫体重 Cotton bollworm larval body weight (mg)1 d3 d7 d9 dCry1Ac1.28±0.22dD1.50±0.51dC3.50±1.26dD8.92±1.61dDCry1Ab0.98±0.03dD1.89±0.14dC8.07±2.01dD15.41±3.63dDCry2Ab1.17±0.18dD3.02±0.96cdC30.45±3.30cC68.89±6.67cCCry1Ah1.86±0.17cC4.52±0.20cC33.23±3.26cBC67.35±11.70cCCry2Aa3.13±0.10bB12.45±1.09bB72.97±8.85bB158.87±0.85bBCry1Ca4.46±0.57aA18.87±2.78aA188.09±31.36aA331.63±9.14aACK3.62±0.19aA16.73±0.78aA175.97±32.38aA336.54±11.65aA

表中不同字母表示数据经Duncan氏法多重比较差异显著，大写字母表示差异极显著(P<0.01),小写字母表示差异显著(P<0.05)。Different letters represent significant differences among treatments when using a Duncan′s multiple ranging test. Capital letters show highly significant differences (P<0.01) and small letters, significant differences (P<0.05).

表3 1.0 μg ·g-1的6种Bt蛋白分别处理棉铃虫2龄幼虫后生物学参数的显著差异Table 3 Responses of cotton bollworm fed with 1.0 μg of the six types of Bt proteins /g food

表中不同字母表示数据经Duncan氏法多重比较差异显著，大写字母表示差异极显著(P<0.01),小写字母表示差异显著(P<0.05)。Different letters represent significant differences among treatments when using a Duncan′s multiple ranging test. Capital letters show highly significant differences (P<0.01) and small letters, significant differences (P<0.05).

3 讨论

本文系统测定了Cry1Ac、Cry1Ab、Cry2Ab、Cry1Ah、Cry2Aa和Cry1Ca 6种蛋白对棉铃虫幼虫的毒力，国内外也有一些文献报道了Cry蛋白对棉铃虫毒力(韩岚岚等，2008；Leeetal.,1996; Chakrabartietal.,1998; Kaliaetal.,2005; Li & Bouwer,2012)。

在澳大利亚，已报道只有Cry1Ab、Cry1Ac、Cry2Aa和Cry2Ab蛋白能够在可接受的剂量下杀死棉铃虫，而Cry1Ca被认为对棉铃虫是无毒的(Liaoetal.,2002)。在印度，Cry1Ac对棉铃虫幼虫的毒力最大，Cry1Ab和Cry1Aa次之(Kaliaetal.,2005)。在南非，Cry1Ac和Cry2Aa对棉铃虫的毒力最大，Cry1Ab次之，Cry1Aa毒性较小(Li & Bouwer,2012)。在中国，Cry1Ac被认为是对棉铃虫幼虫毒力最强的Cry蛋白，Cry2Ab次之，此外，Cry1Ah对棉铃虫幼虫也有一定的杀虫活性，但由于纯化时易形成寡聚体导致其杀虫活性不很稳定(韩岚岚等，2008; 周子珊等，2011)。而本试验中测得的LC50显示，Cry1Ab和Cry1Ac对棉铃虫幼虫的毒力最强，Cry2Ab次之，Cry1Ah和Cry2Aa对棉铃虫幼虫毒性较低。由此可见，不同国家和地区的棉铃虫种群对同一Bt毒素的敏感性存在差异，其原因可能是长时间的地理隔离。

估算棉铃虫田间种群抗性基因频率时，一般采用Wuetal.(1999)确定的1.0 μg·mL-1饲料为诊断浓度。李海强等(2012)对新疆北部地区转Bt基因棉外源蛋白的表达量进行了测定，发现4个品种苗期叶片的Bt(Cry1Ac)蛋白含量平均为1.0 μg·g-1左右时，对当地棉铃虫有较好的控制作用。本试验以相同质量浓度(1.0 μg·g-1)的6种Bt蛋白分别对棉铃虫初孵幼虫、1龄幼虫和2龄幼虫进行处理，发现Cry1Ab和Cry1Ac对3种发育状态下的棉铃虫幼虫毒性均是最强，用这2种蛋白对2龄幼虫连续处理，棉铃虫羽化率为0，不能完成整个生长发育。Cry2Ab对2龄前的幼虫控制效果较好，但对2龄幼虫控制较差；而Cry1Ah和Cry2Aa对2龄前的棉铃虫毒力接近，LC50几乎相近，但两者对2龄幼虫控制效果却相差很大，可能是由于Cry1Ah蛋白纯化过程中形成了寡聚体，杀虫活性不稳定引起的(周子珊等，2011)。

为了阻止或推迟靶标害虫对Cry1Ac蛋白抗性的产生，人们提出了多基因策略，即将多个Bt基因同时转入植物中用来控制农田害虫，Cry1Ac和Cry2Aa、Cry1Ac和Cry2Ab可被同时转入植物中控制棉铃虫，因为这2个蛋白可使用不同的受体结合位点(Cacciaetal.,2010；Gahanetal.,2005)。对Cry1Ac产生抗性的棉铃虫品系，对Cry2Aa和Cry2Ab是敏感的(Akhursttetal.,2003)。而对Cry2Ab产生抗性的棉铃虫品系，则被认为对Cry2Aa也有抗性，但对Cry1Ac敏感(Mahonetal.,2007)。尽管Cry2Ab、Cry2Aa和Cry1Ah对棉铃虫幼虫的毒性不如Cry1Ab和Cry1Ac，但是仍然可以作为控制中国棉铃虫幼虫的替代策略。

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