针灸内关预处理对心肌缺血再灌注损伤兔血清NO、NOS及腺苷含量的影响*

阳晶晶 严 洁 王 超△ 常小荣 刘 密

林海波2 谢文娟1 贺香嫦1 张佳丽1 刘 昭1

（1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.广东省五邑中医院，广东 江门 529000）

针灸内关预处理对心肌缺血再灌注损伤兔血清NO、NOS及腺苷含量的影响*

阳晶晶1严 洁1王 超1△常小荣1刘 密1

林海波2谢文娟1贺香嫦1张佳丽1刘 昭1

（1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.广东省五邑中医院，广东 江门 529000）

目的 观察针灸内关预处理对心肌缺血再灌注损伤兔血清一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶（NOS）及腺苷含量的影响。方法 将32只新西兰大耳白兔随机分为假手术组、缺血再灌注组、电针组和艾灸组。采用结扎左冠状动脉前降支40 min再灌注60 min的方法，建立心肌缺血再灌注损伤模型。假手术组于末次捆绑结束48 h后开胸，穿线静置40 min，拔线，继续静置60 min后取材；缺血再灌注组于末次捆绑结束后48 min行缺血再灌注后取材，电针组和艾灸组分别在针刺、艾灸内关穴之后48 h再行缺血再灌注。高效液相色谱法测定血清腺苷含量，采用硝酸还原酶化学比色法检测血清NO、NOS的含量。结果 缺血再灌注组血清NO、NOS及腺苷的含量较假手术组相比明显下降（P＜0.05）；电针组与艾灸组血清NO、NOS及腺苷的含量较缺血再灌注模型组相比均明显升高（P＜0.01），而电针组与艾灸组两组间无明显差异（P＞0.05）。结论 电针、艾灸内关穴预处理可以提高兔血清中NO、NOS及腺苷的含量，即可以增强延迟性保护机制的细胞信号转导通路中触发物质NO、NOS、腺苷的活性和含量，表明了针灸预处理内关穴可以在48 h这一延迟时相产生针对缺血再灌注损伤心肌的保护作用。

针灸预处理 心肌缺血再灌注损伤 内关 NO NOS 腺苷

目前，缺血性心脏病的发病率呈逐年上升趋势，缺血性心血管病占我国心血管病总发病数的65%［1］。缺血性心脏病的治疗关键是以恢复冠脉灌注为核心。研究发现，冠脉的骤然开通与血流恢复，会引起心肌缺血再灌注损伤（MIRI）。本课题组早在前期做了大量研究工作，证实了针灸预处理能够通过多种途径对大鼠、家兔MIRI起到保护作用［2-8］。本实验以心肌缺血再灌注兔为模型，通过对延迟性保护机制的细胞信号转导通路中触发物质一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶（NOS）、腺苷的活性和含量的比较，观察针灸内关预处理对MIRI的延迟保护作用。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物来源及分组 选用新西兰大耳白兔共32只，由湖南中医药大学动物实验中心提供（清洁级），每只分笼圈养于动物中心实验室。体质量1.5～2.5 kg，月龄3～4个月，雌雄兼用，饲养温度20～25℃，湿度50%～70%。分组采用完全随机方法，将其分为假手术组，缺血再灌注组，电针组，艾灸组，每组各8只。

1.2 干预方法 （1）假手术组。将兔捆绑固定于兔台上，每次20 min，每日1次，连续5 d。于末次捆绑结束后48 h按缺血再灌注造模的起始流程开胸，穿线静置40 min，拔线，继续静置 60 min后取材。（2）缺血再灌注组。将兔捆绑固定于兔台上，每次20 min，每日1次，连续5 d。于末次捆绑结束后48 h行缺血再灌注后取材。（3）电针及艾灸组。将兔捆绑固定于兔台上之后，相应行电针、艾灸预处理，每次20 min，每日1次，连续5 d。于末次捆绑结束后48 h行缺血再灌注后取材。

1.3 模型制备 兔称质量后经耳缘静缓慢推注20%乌拉坦（4 mL/kg）作全身麻醉，麻醉成功后继续经耳缘静脉缓慢滴入5%葡萄糖注射液。将兔仰位固定在兔台上，左胸前区去毛，碘伏皮肤消毒，铺无菌洞巾；将心电图肢导联的针形电极刺于兔皮下，红色电极与右上肢相连，黄色电极与左上肢相连，绿色电极与左下肢相连，标准电压为10 mm/mv，走纸速度为50 mm/s；沿胸骨正中线左侧旁开1～2 cm处切开皮肤，切口约5 cm，显露肋骨，从第3、4肋间隙处钳夹预防出血后，剪断上下两肋，以乳突牵开器适度撑开胸壁，此时可见心脏；用无齿镊夹住已被剪开的心包膜，将心脏轻轻向上提起，以左冠状动脉主干为标志，再用持针器持无创性小圆弯针在左冠状动脉前降支上、中1/3交界处穿一根零号医用缝合线，将缝合线两端套入一直径为2 mm长度为3 cm的硅胶管，用止血钳将硅胶管送入紧贴心壁，连丝线一起夹紧后即为结扎血管；立即心电图监测，以左室前壁发绀及心电图ST段抬高为缺血达成的标志，合拢胸腔，生理盐水纱块覆盖切口，持续结扎40 min后开胸，松开止血钳以释放硅胶管，恢复左前降支灌流60 min。

1.4 针灸操作 将兔固定于兔台上后，电针组采用华佗牌SDZ-Ⅱ型电子针疗仪 （苏州医疗用品有限公司）电针双侧内关穴，直刺入穴位约0.5 cm，行小幅度捻转手法（平补平泻）1 min后接电针（内关穴接刺激较强的负极，正极接兔尾部）。刺激参数：疏密波，疏波10 Hz，密波50 Hz，强度以双上肢轻微颤动为度。艾灸组采用“神灸300灸”艾柱（每壮含艾绒约0.2 g，苏州东方艾绒厂生产）灸兔双侧内关穴，以上均操作时间20 min，每日1次，共5 d。

1.5 标本采集与检测 动物经历缺血40 min、再灌注60 min后，兔颈部去毛沿气管正中线切开皮肤，将一侧颈动脉行钝性分离，用2支6 mL无抗凝剂的真空采血管取颈动脉血各3 mL，3000 r/min离心10 min分离血清，移液枪分别吸取上清0.5 mL至Eppendorf离心管内，-20℃冰箱冻存，采用硝酸还原酶化学比色法检测血清NO、NOS的含量，高效液相色谱法测定血清腺苷含量。

1.6 统计学处理 应用SPSS16.0统计软件。计量资料以（±s）表示。所有数据进行正态性检验，满足正态性时，采用单因素方差分析。组间比较若方差齐时采用LSD法检验，方差不齐时用Tamhane’s T2法检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组MIRI兔血清中NO、NOS含量的比较 见表1。缺血再灌注组血清NO、NOS的含量较假手术组相比明显下降（P＜0.05）；电针组与艾灸组血清NO、NOS的含量较缺血再灌注模型组相比均明显升高 （P＜0.01），而电针组与艾灸组两组间无明显差异 （P＞0.05）。以上结果提示，电针、艾灸内关穴预处理可以使心肌缺血再灌注损伤兔血清中NO的含量升高，NOS的活性增强。

表1 各组兔血清中NO、NOS、腺苷含量比较（±s）

表1 各组兔血清中NO、NOS、腺苷含量比较（±s）

与假手术组相比，△P＜0.05；与缺血再灌注组相比，▲P＜0.01。

组 别 n 腺苷（ng/mL）NO（μmol/L） NOS（μmol/L）电针组 8 131.11±18.33▲艾灸组 8 131.76±27.89▲缺血再灌注组 8 82.62±13.85△30.18±3.71▲ 30.2±2，46▲32.86±4.30▲ 30.03±2.06▲24.08±1.14△ 24.62±1.72△假手术组 8 107.28±5.24 27.58±3.25 27.21±1.73

2.2 针灸内关预处理对MIRI兔血清腺苷含量的影响见表1。缺血再灌注组血清腺苷的含量较假手术组相比明显下降（P＜0.05）；电针组与艾灸组血清腺苷的含量较缺血再灌注模型组相比均明显升高（P＜0.01），而电针组与艾灸组两组间无明显差异（P＞0.05）。以上结果提示，电针、艾灸内关穴预处理可以使心肌缺血再灌注损伤兔血清中腺苷的含量升高。

3 讨 论

NO和NOS在心肌缺血再灌注损伤中有重要作用［9］。NO是一种生物活性分子，不仅参与了对冠脉血管舒缩的调控，维持有效的冠脉循环血流，而且对缺血后心肌的转归及心肌功能的恢复可能起着重要的作用。当心肌发生MIRI损伤时，明确缺血心肌处NO变化规律及NO对心肌功能的影响有着重要临床意义。NOS为一含铁的单氧化酶，心肌中的NOS是NO的限速酶，其同功酶的活性影响着NO的生物效应［10］。Johnson等最早提出NO可减轻心肌缺血再灌注损伤［11］。心肌缺血性损伤时cNOS mRNA呈低表达，NOS活性降低，心肌NO的合成和释放减少，血清NO浓度下降［12-13］。

腺苷是体内一种内源性嘌呤核苷酸，是ATP降解过程中的中间产物。在冠状动脉的自动调节中发挥重要作用。腺苷具有广泛的心血管效应，能够抑制内皮素和去甲肾上腺素释放，扩张冠脉，抑制血小板凝集，保护微血管结构，减少中性粒细胞激活，减缓能量消耗，刺激糖酵解，减少超氧阴离子产生。腺苷为一种内源性抗炎物质，可以降低肿瘤坏死因子-α的合成，而肿瘤坏死因子-α是IR损伤作用的主要炎症介质［15］，从而起到抗炎作用，保护心肌。

本实验选用的是内关穴，为手厥阴心包经之络穴，又为八脉交会穴，通于阴维脉，手厥阴心包经起于胸中，出属心包络，向下通过横膈，从胸至腹依次联络上、中、下三焦，主治心痛、胸闷、心烦等疾患。心包络为心“臣使之官”，代心受其损，心主血脉，又主神明，故内关穴可治疗心疾血证。《针灸甲乙经》云“实则心暴痛，虚则心烦，心惕惕不能动，失智，内关主之”。《难经》曰“阴维为疾苦心痛”。《针灸缝源》云“治心暴痛，支满肘挛，疟疾气短”。后人又总结出“心胸内关谋”，都说明了内关穴对治疗心脏疾病具有特异性。

大量的动物实验证明电针内关穴对大鼠、兔心肌缺血再灌注具有保护作用，而这类的研究多集中在针刺的即时保护效应，而针刺的延迟保护作用则较为偏少。易受乡等发现，针刺内关穴对心肌缺血具有24 h后的延迟保护作用［8］。 基于缺血预适应（IP）的“第二保护窗”其时间长达 24～72 h［16］，故本实验选定观察针灸后48 h是否具有延迟保护作用。值得重视的是，目前对于心肌缺血治疗大多集中在针刺，而对于艾灸的研究不多见，故本实验设立的艾灸组，有利于艾灸治病防病的推广，扩大针灸的应用范围。本研究通过对兔实行连续5 d电针、艾灸内关穴预处理，48 h后再造模取材，对内源性保护物质血清NO、NOS和腺苷含量的测定，来判断针灸内关预处理对心肌的延迟保护效应。实验结果证实电针、艾灸内关穴预处理可以提高兔血清中NO、NOS及腺苷的含量，即可以增强延迟性保护机制的细胞信号转导通路中触发物质NO、NOS、腺苷的活性和含量，表明了针灸预处理内关穴可以在48 h这一延迟时相表达出针对缺血再灌注损伤的心肌保护作用。本实验研究结果可以为“心胸内关谋”理论提供实验依据，有利于针灸“治未病”在临床的推广。

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［2］田岳凤，严洁，林亚平，等.电针“内关”对心肌缺血再灌注损伤内皮素及超微结构的影响［J］.中国针灸，2002，22（8）：547-549.

［3］田岳凤，林亚平，严洁，等.电针内关穴对心肌缺血-再灌注损伤预防保护作用的实验研究（Ⅰ）——对CK、ET、MDA、NO、NOS 等的影响［J］.中国中西医结合急救杂志，2002，9（1）：12-14.

［4］田岳凤，易受乡，严洁，等.电针内关穴对心肌缺血-再灌注损伤预防保护作用的实验研究（Ⅱ）——对超微结构及细胞凋亡的影响［J］.中国中西医结合急救杂志，2002，9（1）：15-18.

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［6］易受乡，杨昱，林亚平，等.电针内关对家兔心肌缺血再灌注损伤延迟保护作用的研究［J］.中国中医药信息杂志，2002，9（10）：29-31.

［7］易受乡，林亚平，严洁，等.针刺内关与缺血预处理对心肌缺血再灌注损伤保护作用的比较［J］.中国中医基础医学杂志，2001，7（8）：56-58.

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The Effect of Acupuncture at Neiguan（PC6） Pretreatment on the Expression of Blood Serum NO，NOS，and Adenosine in Rabbits with MIR

YANG Jingjing，YAN Jie，WANG Chao，et al.Hunan University of Chinese Medicine，Hunan Changsha410208，China

Objective:To observe the effect of acupuncture at Neiguan （PC6） pretreatment on the expression of NO，NOS，and adenosine.Methods:32 New Zealand big-ear rabbits were randomly divided into 4 groups:shamoperation group，ischemia reperfusion group，electric acupuncture preconditioning group and moxibustion pretreatment group.Myocardial ischemia-reperfusion injury model was established by the method of Ligating the anterior descending branch of the left coronary artery for 40 min and then reperfusing for 60 min.After the last bunding for 48 h，rabbits in sham-operation group were chest-opened，threaded and standed for 40 min，then the line was pulled out and standed for 60 minutes，then samples were selected.After the last bunding for 48 mins，rabbits in ischemia reperfusion group were conducted ischemia-reperfusion，then samples were selected；rabbits in electric acupuncture preconditioning and moxibustion pretreatment group were acupunctured at Neiguan （PC6） acupoint respectively.After that for 48 h，ischemia-reperfusion was conducted.Serum adenosine content was determined by high performance liquid chromatography；the content of serum NO and NOS was determined by ELISA method.Results： NO，NOS，and adenosine contents of ischemia-reperfusion group decreased significantly than those of control sham-operation group with statistical difference （P＜0.05）；NO，NOS，and adenosine contents of electric acupuncture preconditioning and moxibustion pretreatment group increased significantly than those of control ischemia-reperfusion group with obviously statistical difference （P＜0.01），but there was no significantly difference between electric acupuncture preconditioning and moxibustion pretreatment group（P＞0.05）.Conclusion： Electric acupuncture pretreatment and moxibustion pretreatment can increase the release of endogenous protection materi-als in serum of MIRI rabbits such as NO，NOS，and adenosine，which indicates the protective effect of acupuncture at Neiguan（PC6） pretreatment on ischemical reperfusion injury in 48 h.

Acupuncture pretreatment；MIR；Neiguan（PC6） acupoint；NO；NOS；Adenosine

R246

A

1004-745X（2014）07-1209-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.07.001

国家自然科学基金项目（81072868）；国家自然科学基金青年项目（81102661）；中国中医科学院自主开放项目（ZZKF06008）；湖南省研究生科研创新项目（CX2011B338）；浙江省“重中之重”学科开放基金项目（ZTK2010B05）；湖南省教育厅课题（08C633）；湖南省教育厅课题项目（2013sk3086）

△通信作者

2014-02-31）