原发性小肠腺癌中PTEN蛋白及PCNA的表达及临床意义

吴晓华 张莘 周文阔

·论著·

原发性小肠腺癌中PTEN蛋白及PCNA的表达及临床意义

吴晓华 张莘 周文阔

目的 检测PTEN蛋白和PCNA在原发性小肠腺癌组织、癌旁组织及正常小肠组织中的表达，探讨其与原发性小肠腺癌的关系，为原发性小肠腺癌预后判断提供依据。方法采用SP免疫组化法对32例小肠腺癌及其相应癌旁组织、8例正常小肠组织进行PTEN蛋白及PCNA的定位观察。结果原发性小肠腺癌组织中PTEN蛋白阳性率为71.88%(23/32),相应癌旁组织及正常小肠组织中PTEN蛋白未阳性率分别为15.63%(5/32)、2.50%(1/40)，2组比较差异有统计学意义(P<0.05)；原发性小肠腺癌组织中PTEN蛋白的表达与其分化程度及有无淋巴结转移相关(P<0.05)。原发性小肠腺癌组织中PCNA阳性率为65.63%(21/32),相应癌旁组织6.25%(2/32)及正常组织PCNA阳性率为2.50%(1/40)，二者比较差异有统计学意义(P<0.05)；原发性小肠腺癌组织中PCNA的表达与肿瘤部位、浸润深度、分化程度相关(P<0.05)。结论小肠腺癌中PTEN蛋白和PCNA的高表达可作为判断预后的有效指标，两者联合检测可早期诊断小肠腺癌并判断预后。

腺癌，小肠；免疫组织化学 ；PTEN；增殖细胞核抗原；预后

PTEN抑癌基因对肿瘤的发生、发展起到重要作用，与肿瘤的侵袭和预后紧密相关，内源性增殖细胞的标记物增殖细胞核抗原(PCNA)的表达水平与肿瘤增殖有关。本研究采用免疫组织化学技术，探讨抑癌基因PTEN蛋白和PCNA在原发性小肠腺癌中的表达及其与原发性小肠腺癌发生、发展及临床预后性指标的关系，为判断预后提供参考指标。

1 资料与方法

1.1 一般资料 标本取自我院普通外科2004年4月至2007年10月手术切除的原发性小肠腺癌32例，术前均未行放、化疗，男13例，女19例；年龄32～82岁，平均55.6岁。病变位于十二指肠22例，空肠4例，回肠6例；按小肠腺癌病理分化程度不同分高分化组9例、中分化组14例、低分化组9例。按淋巴结有无转移分淋巴结转移20例、无转移12例。癌组织和癌旁组织分别制作病理切片3张，1张行HE染色重新病理确诊，2张分别行PTEN和PCNA的免疫组化染色。取8例正常小肠组织蜡块作为对照。均有完整随访资料。

1.2 试剂 鼠抗人PTEN单克隆抗体、鼠抗人增殖细胞核抗原单克隆抗体分别购自北京中山生物技术有限公司和上海瑞齐生物科技有限公司，ABC药盒及试剂购自华美生物工程公司。

1.3 免疫组织化学染色 所有标本经10%甲醛固定，石蜡包埋，连续切片，厚4 μm。参照ABC法进行免疫组化染色。PTEN阳性对照选用已知的乳腺癌标本，PCNA阳性对照选用食管鳞癌标本。阴性对照以PBS替代一抗。

1.4 结果判断 免疫组织化学染色结果采用半定量计数方法，由两位病理科高年资医师随机选取10个高倍视野进行评判，PTEN蛋白和PCNA的阳性结果为细胞核棕褐色颗粒，具体计分方法为IRS=染色强度(SI)×阳性细胞百分比(PP)。SI分4个等级，0为阴性，1弱阳性，2中度阳性，3强阳性；PP分5个等级，0级为无阳性染色，1级为 10%，2级为10%～50%，3级为51%～80%，4级为80%以上。IRS结果在0～12分，积分在2分以上为阳性。

1.5 统计学分析 应用SPSS 17.0软件包进行数据处理，计数资料采用χ2检验，生存曲线用Log-rank test，预后多因素分析应用Cox风险比例模型进行分析。

2 结果

2.1 PTEN蛋白和PCNA的表达 PTEN蛋白免疫组化染色阳性产物主要存在于细胞核，呈棕黄色或深褐色颗粒。32例小肠腺癌组织中PTEN 蛋白表达阳性率为71.88%(23/32)，对照切片阴性。癌旁组织及正常小肠组织分别为15.63%(5/32)、5.00%(2/40)。2组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。PCNA表达阳性率为65.63%(21/32)，癌旁组织及正常小肠组织分别为6.25%(2/32)、2.50%(1/40)，2组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。低分化组PTEN 蛋白表达阳性66.7%(6/9),中分化组85.71%(12/14)及高分化组88.89%(8/9)，两两比较差异均有统计学意义(P<0.05),而在不同性别、肿瘤大小、浸润深度差异无统计学意义(P>0.05) ，淋巴结转移组的PTEN 蛋白表达80.00%(16/20)低于淋巴结无转移组91.67%(11/12),但差异无统计学意义(P>0.05)。表明PTEN基因的缺失导致PTEN 蛋白降低，致使小肠腺癌细胞的生长、分裂不受控制，脱离了正常生长调控状态，癌细胞呈无节制的生长。小肠腺癌分化程度越低，PTEN蛋白表达越低，肿瘤的恶性度越高。PCNA表达阳性率为65.63%(21/32)，癌旁组织及正常小肠组织分别为6.25%(2/32)、2.50%(1/40)，2组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。低分化组PCNA表达阳性率88.89%(8/9),中分化组71.43%(10/14),高分化组55.56%(5/9)，两两比较差异均有统计学意义(P<0.05),而在不同性别、肿瘤大小、肿瘤部位、浸润深度差异无统计学意义(P>0.05)，淋巴结转移组的PCNA表达(15/20，75.00%)高于淋巴结无转移组(7/12，58.33%)，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1、2。

表1 小肠腺癌组织、癌旁组织及正常小肠组织PTEN蛋白和PCNA的表达比较 例(%)

表2 小肠腺癌组织PTEN蛋白和PCNA的表达影响因素分析 例(%)

2.2 PCNA和PTEN蛋白联合表达情况与临床病理学指标和预后的关系 将小肠腺癌组织PCNA和PTEN蛋白表达结果进行组合，PCNA (-)/PTEN (+)组多见于肿瘤中早期肿瘤(63.17 %，12/19)，PCNA(+)/PTEN(-)组多见于晚期肿瘤(71.43%，5/7)，且PCNA (-)/PTEN (+)组以无淋巴结转移为主(66.67%，10/15)，而PCNA(+)/PTEN(-)组以有淋巴结转移为主(71.43%，5/7)。PCNA (-)/PTEN (+)组5年生存率最高达70.6%，与其他各组两两比较差异有统计学意义(P<0 01)，而PTEN蛋白阳性组及阴性组5年生存率比较差异无统计学意义 (P<0.05)。表明联合检测PCNA和PTEN蛋白可进一步明确小肠腺癌分期及判断预后。

2.3 其他 将影响小肠腺癌患者预后的各种因素(性别、肿瘤大小、分化程度、浸润深度、淋巴结转移、PCNA表达、PTEN蛋白表达及4组不同PCNA和PTEN蛋白联合表达情况)经Cox风险比例模型分析，结果显示影响小肠腺癌预后的因素主要为淋巴结有否转移及PCNA /PTEN联合表达情况(P<0. 01)，无淋巴结转移(P<0. 01)和PCNA (-)/PTEN (+)(P<0. 01)预后较好，而其他指标均未显示出统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

小肠约占胃肠道全长的75%，其黏膜总面积约占胃肠道表面积90%以上，但小肠肿瘤发病率低，约占胃肠道肿瘤的5%左右，恶性肿瘤发病率约占胃肠道恶性肿瘤的2%左右[1]。以腺癌及类癌最为常见，约占小肠恶性肿瘤的55%～80%。研究抑癌基因与PCNA对小肠肿瘤的发生、发展及预后的影响的文章较多，但对抑癌基因PTEN和PCNA在小肠腺癌中的表达的研究国内尚未见报道，我们应用免疫组化方法检测PTEN蛋白及PCNA，从分子水平探讨小肠腺癌发生、发展的原因，寻找早期诊断小肠腺癌的方法，寻找判断小肠腺癌预后的主要因素。PTEN是1997年发现的一个新抑癌基因[2]， PTEN蛋白含有一酪蛋白磷酸酶的功能区和约175个氨基酸与张力蛋白和辅助蛋白同源的区域。PTEN决定性的负性调节作用普遍存在于P13K信号通路中，从而发挥转换和调节生长、繁殖及存活信号[3]。许多癌基因的产物都是通过磷酸化而刺激细胞生长，PTEN基因通过其脂质磷酸化酶活性使P IP3 去磷酸化，促进细胞凋亡，阻止不受控制的细胞生长，参与细胞调控，从而限制肿瘤的形成。本研究中，PTEN蛋白表达阳性率为71.88%(23/32)，PTEN蛋白表达与小肠癌组织分化程度呈正相关 (P<0.05)， 而与患者性别、年龄、肿瘤临床分期、淋巴结转移与否和5年生存率无关(P>0.05) ，提示由于抑癌基因PTEN基因缺失，导致PTEN蛋白的丢失，从而使得小肠癌细胞原有的正常生长调控状态发生紊乱，促使肿瘤细胞无节制的生长， PTEN蛋白越少，小肠腺癌细胞的分化程度就越低，其恶性度越高。检测小肠腺癌组织抑癌基因PTEN蛋白的表达，有助于早期诊断小肠腺癌，并对小肠腺癌预后进行更准确的评估。

PCNA于1978年首次发现，是一种相对分子质量为3.6×104的酸性核蛋白，共261 个氨基酸，其中酸性氨基酸明显多于碱性氨基酸[4]。PCNA在DNA 链的损伤、修复、复制等环节中起关键作用，能够加快DNA的合成速度。PCNA在细胞周期G2、M期最少，从G1 期开始合成，逐渐增加，S 期达到高峰[5]，其量的变化与和DNA 合成一致。PCNA 阳性表达的强弱直接反映了细胞增殖活动的高低，是评价细胞增殖状态的良好指标，由于肿瘤细胞普遍具有旺盛的增殖能力，所以在许多肿瘤研究中显示PCNA与肿瘤的发生、发展、恶性程度、分期及预后有关。大量研究表明，PCNA可作为组织癌变的一个标记物，亦可作为临床判断肿瘤恶性程度的指标[6]，PCNA高表达也是肿瘤预后不良的标志。本研究中，PCNA在癌组织、癌旁及正常小肠组织中的表达表现为递减，在低分化组、中分化组及高分化组中递减。淋巴结转移组(75.00%)高于无淋巴结转移组(58.33%)，差异有统计学意义(P<0.05)，本研究结果提示，PCNA表达越强，小肠腺癌细胞的增殖越不受控制，导致小肠腺癌的分化越差，淋巴结越易发生转移，预后不良， PCNA可作为判断小肠腺癌恶性程度及预后的有效指标。在本研究中PCNA (-)/PTEN (+)组5年生存率最高达70.6%，明显优于单独检测PCNA和PTEN蛋白对预后的判断。

综上所述，小肠腺癌组织中PTEN蛋白表达与PCNA表达一致，但在小肠腺癌分化程度上表达相反，抑癌基因PTEN基因的缺失导致PTEN蛋白减少，促使小肠腺癌细胞的正常生长调控状态出现紊乱并产生肿瘤细胞无节制的生长， PTEN蛋白表达越减少，肿瘤 细胞的分化程度就越低，肿瘤的恶性度越高；而小肠腺癌分化越差，细胞凋亡减少，细胞增殖活动明显增强，所以PCNA表达越强，小肠腺癌的分化越差，越易发生淋巴结转移。我们推测抑癌基因PTEN的缺失及PCNA增多协同作用导致小肠腺癌恶性程度增高，预后不良，所以联合检测PTEN蛋白、PCNA可作为判断肿瘤分级及预后的重要参考指标。

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5 Zheng L,Dai H,Hegde ML,et al.Fen1 mutations that specifically disrupt its interaction with PCNA cause aneuploidy-associated cancer.Cell Res，2011，21：1052-1067.

6 Chen YC,Ren F,Sang JR,et al.Type II Cgmp-dependent protein kinase inhibits proliferation of the gastric cell line BGC-823.Mol Med Report，2010,3:361-366.

ExpressionofPTENproteinandPCNAinprimarysmallboweladenocarcinomaandSignificancy

WUXiaohua，ZHANGShen，ZHOUWenkuo.DepartmentofGeneralSurgery,TheFirstHospitalofQinhuangdao,Hebei,Qinhuangdao066000,China

adenearcinoma intestine，small；protein PTEN；proliferating cell nuclear antigen；immunohistochemistry;prediction

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.03.003

060000 河北省秦皇岛市第一医院普通外科

R 735.3

A

1002-7386(2014)03-0330-03

2013-09-11)

AbstrctObjectiveTo detect PTEN protein and proliferatingcell nuclear antigen(PCNA)in primary small bowel adencareinoma(SBAC) tissue，adjacent nontumorons tissue,and normal small bowel tissue,to investigate the relationship between the expression of tumor suppressor gene PTEN protein and PCNA and the biologcal behaviors of primary small bowel adencareinoma.MethodsExpression of PTEN protein and PCNA location were examined by streptavidin-peroxidase immunohistochemistry method in 32 SBAC，the corresponding adjacent nontumorons tissue and 8 normal small bowel tissues.ResultsExpression of PTEN protein was detected in 71.88% of the primary SBAC tissue，while expression in adjacent nontumorous tissue and normal small bowel tissue was detected in 15.63% and 12.50% (P<0.05)．The positive expression of PTEN was significantly related to the cell differentiation，diversion of ganglia lymphatica in primary SBAC tissue(P<0.05).Expression of PCNA was detected in 65.63% of the primary SBAC tissue. 6.25% of the adjacent nontumor tissue and 2.50% normal small bowel tissue(P<0.05)；The positive expression 0f PCNA was a significantly related to the tumor location，tumor infiltration depth and cell differentiation in primary SBAC tissue(P<0.05).ConclusionExpression of tumor suppressor gene PTEN and PCNA could be helpful in predicting the biological behavior and prognosis of primary SBAC．