紫外分光光度法检测血液诊断佐匹克隆中毒的方法

白云 陈兴 杜书明 范川鹏

·药物研究·

紫外分光光度法检测血液诊断佐匹克隆中毒的方法

白云 陈兴 杜书明 范川鹏

目的 探讨建立血清中佐匹克隆定性、定量的紫外分光光度法测定，为临床佐匹克隆中毒提供诊疗依据。方法取0.5 ml血清加0.5 mol/L盐酸0.1 ml混匀，再加10%高氯酸甲醇溶液0.1 ml沉淀蛋白，充分震荡混匀，置-18℃冰箱冷冻10 min，以12 000 r/min高速离心，取上清液50 L于微量比色池中紫外扫描。结果血清中佐匹克隆最大吸收峰(310±1)nm，浓度在3.0～30.0 g/ml范围内呈线性，回归方程y=0.0158x+0.0052，其相关系数为0.9995,方法回收率为86.8%～102.8%；相对标准差(RSD%)为3.3%～4.8%。日内、日间RSD%分别为2.45%～4.78%和2.75～4.81%，最低检出浓度：2.0 g/ml。结论该方法操作简便、分析快速，结果准确，为临床诊断佐匹克隆中毒提供了一个简便准确的检测方法。

血液；佐匹克隆；紫外扫描；定性；定量

佐匹克隆(zopiclone)为环吡咯酮类第三代镇静催眠药，是国内外近年来用于临床的一种新药。随着这一新型药物在临床上的应用，出现误服、自杀或投毒的案件呈上升趋势，遇到中毒昏迷的患者，临床医生迫切需要了解中毒安眠药物的类型，以求对症治疗。我们参考有关文献[1-5]探讨了中毒患者血液中佐匹克隆成分定性、定量的紫外分光光度法。该方法提取过程简单、仪器相对价廉，且具有快速、准确、灵敏的优点，在临床应用中取得了满意结果。

1 仪器与方法

1.1 仪器与试剂 UV-2600双光速紫外/可见分光光度计，50 L微量比色池(上海天美科学仪器有限公司)；LG16-B高速离心机(北京雷勃尔离心机有限公司)；冰箱；电热恒温水箱；SK-1型快速混匀器(常州国华电器有限公司)。佐匹克隆标准品，纯度为99.0%(天津市药品研究所提供)，高氯酸、甲醇、盐酸为分析纯；带盖的5.0 ml塑料试管；健康人混合血清，佐匹克隆中毒患者血清来源于医院急诊科。

1.2 工作曲线的绘制 准确配制0.1 mol/L盐酸溶液，用0.1 mol/L盐酸溶液配制100 g/ml的佐匹克隆标准贮备液。取配制好的100 g/ml的佐匹克隆标准贮备液，用健康人混合血清逐级稀释为30.0、20.0、10.0、5.0、1.0、0.5、0.00 g/ml的佐匹克隆工作应用液，分别取0.5 ml于7个带盖的容积5.0 ml塑料试管中(最后一管不含佐匹克隆，作为空白管)。加0.5 mol/L盐酸溶液0.1 ml，然后各加10%高氯酸甲醇溶液0.1 ml沉淀蛋白，于SK-1型快速混匀器混匀后，置于冰箱-18℃冰冻10 min，室温融化，然后以12 000 r/min高速离心5 min，取上清液备用。设定扫描波长范围为200～400 nm。取空白管上清液50 L做基线测量，然后扫描不同浓度的佐匹克隆标准上清液，佐匹克隆最大吸收峰在(310±1)nm。见图2。按上述操作方法做5次平行试验，根据在(310±1)nm测定的平均吸光度值(y)并对佐匹克隆质量浓度(x)进行回归，得线性回归方程y=0.0158x+0.0052，相关系数r=0.9996,线性范围为3.0～30 g/ml，本法测定佐匹克隆最低检出浓度为2.0 g/ml。

1.3 样品测定 取带盖塑料试管标注V(患者)和B(空白)，V管加患者血清或血浆0.5 ml，B管加健康人混合血清0.5 ml，加0.5 mol/L盐酸溶液0.1 ml酸化血清，然后各加10%高氯酸甲醇溶液0.1 ml沉淀蛋白，于SK-1型快速混匀器混匀后，置于冰箱-18℃冰冻10 min，室温融化，然后以12 000 r/min高速离心5 min，取上清液备用。设定扫描波长范围为200～400 nm。取空白管B上清液50 L做基线测量，然后扫描待测样品V管。根据(310±1)nm处的最大吸收峰进行定性，查标准曲线或回归方程求出患者血清中佐匹克隆含量。

1.4 血清空白试验 取健康人混合血清0.5 ml分别加入3个带盖的塑料试管中，按前述样品处理及试验方法，用其中一份上清液50 L做基线测量，然后再扫描其它两份空白上清液。见图3。空白实验表明：该试验方法一旦在(310±1)nm出现最大吸收峰，结合临床，应考虑血清中有佐匹克隆成分的存在。

2 结果与讨论

2.1 佐匹克隆检测的最大吸收峰 用0.1 mol/L盐酸溶液配制100 g/ml的佐匹克隆标准贮备液。然后再用0.1 mol/L盐酸稀释佐匹克隆贮备液，使其佐匹克隆浓度为30、20、10 g/ml的标准应用液。以0.1 mol/L盐酸为空白做基线测量，分别对佐匹克隆标准应用液进行扫描。结果佐匹克隆在(303±1)nm处有最大吸收峰。见图1。因此确定(303±1)nm为佐匹克隆片剂检测波长，与有关文献报道相符[1-3]。

2.2 血液中佐匹克隆紫外测定方法的建立 本文参考有关文献[4-9]建立了紫外分光光度法对血中佐匹克隆的定性定量测定，方法见样品测定部分。患者血清或血浆中加入0.5 mol/L盐酸，目的是增加佐匹克隆在血清中的溶解度；加10%高氯酸甲醇溶液，目的是沉淀血清蛋白；高速离心可以使上清液无杂质。血清样品中佐匹克隆最大吸收峰出现在(310±1)nm。见图2。比佐匹克隆标准品最大吸收峰(303±1)nm波长略有“红移”，考虑是佐匹克隆可变异的助色基团溶解在10%高氯酸甲醇溶液中使吸收光谱的位置发生了变化，即“红移”。所以测定血清中佐匹克隆应根据(310±1)nm的最大吸收峰进行定性，查工作曲线或回归方程求患者血清中佐匹克隆含量，患者胃液佐匹克隆测定最大吸收峰为(303±1)nm。

图1 稀盐酸中佐匹克隆标准吸收光谱(303±1)nm

图2 血清中佐匹克隆吸收光谱(310±1)nm

图3 空白血清吸收光谱

2.3 精密度试验 取健康人混合血清20.0 ml，分别配制0.00、5.0、10.0、15.0 g/ml高、中、低三种佐匹克隆浓度血清样品，分别取其0.5 ml于4个带盖的容积5.0 ml塑料试管中。其他操作按样品测定进行。取空白管上清液50 L做基线测量，然后再扫描不同浓度的佐匹克隆血清样品。在同一日不同时间及不同日间按上述方法测定佐匹克隆浓度，计算日内日间相对偏差。见表1。

表1 方法精密度试验结果 n=5，%

2.4 方法回收率试验 取健康人混合血清20.0 ml，分别配制0.00、0.50、5.0、10.0 g/ml的佐匹克隆血清样品，分别取其0.5 ml于4个带盖的容积5.0 ml塑料试管中。其它操作按“样品测定”进行。取空白管上清液50 L做基线测量，然后再扫描不同浓度的佐匹克隆血清样品。在相同条件下测定佐匹克隆浓度(n=5)。其回收率分别为86.8%、102.8%和96.5%；相对标准差(RSD%)分别为：4.8%、3.3%和4.7%。

2.5 干扰试验 取健康人混合血清10.0 ml，配置分别含有安定、多虑平、艾司唑仑、氯氮平和氯美扎酮(5 g/ml)的佐匹克隆标准应用液(5.0 g/ml)。根据样品测定部分操作。结果表明安定、多虑平、氯氮平和氯美扎酮常见镇静类药物对佐匹克隆无干扰。

对于药物中毒的诊断与抢救，既要准确及时，又要对症救治，而紫外分光光度法分析药物是比较简便快速的，并且可以降低有机物的污染。本文探讨了中毒患者血液中佐匹克隆成分定性、定量的紫外分光光度法，该方法提取过程简单、不需要有机溶剂萃取，仪器相对价廉，且具有准确、灵敏的特点。血液中佐匹克隆在310 nm有最大吸收峰，胃液中佐匹克隆最大吸收峰为(303±1)nm。可用于佐匹克隆中毒的诊断。

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050082 石家庄市，白求恩国际和平医院检验实验中心

R 916.62

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1002-7386(2014)03-0440-03

2013-09-18)