肺表面活性物质蛋白 B参与新生儿呼吸窘迫综合征发病可能机制的探讨

陆 芬 （山东省郯城县第一人民医院新生儿科，山东郯城 276100）

·临床与转化医学·

肺表面活性物质蛋白 B参与新生儿呼吸窘迫综合征发病可能机制的探讨

陆 芬 （山东省郯城县第一人民医院新生儿科，山东郯城 276100）

目的：探讨肺表面活性物质蛋白 B（SP-B）参与新生儿呼吸窘迫综合征（RDS）发病的可能机制．方法：选取我院2011-09／2013-09收治的63例因 RDS死亡且无血缘关系的新生儿为 RDS组，分为32周以下组、32～36周组及36周以上组，每组各21例；选取我院收治的63例无血缘关系的非 RDS而死亡的新生儿为对照组，分组方式与 RDS组以 1∶1相对应．结果：RDS组中，肺部表面活性物质蛋白B（SP-B）mRNA阳性的细胞数量随胎龄增加保持不变，而对照组中，肺部表面活性物质蛋白 B（SP-B）mRNA阳性的细胞数量随胎龄增加而升高．RDS组肺部表面活性物质蛋白 B（SP-B）mRNA阳性的细胞数水平显著小于对照组．RDS组肺表面活性物质蛋白SP-B缺陷频率为14．29%，明显大于对照组（1．59%）；RDS组肺表面活性物质蛋白 SP-BmRNA缺陷频率42．86%，也明显大于对照组7．94%．结论：SP-BmRNA的缺失也是引发 RDS病的因素之一．

呼吸窘迫综合征；新生儿；肺表面活性物质蛋白 B

0 引言

引发新生儿呼吸系统衰竭的常见病症之一就是新生儿呼吸窘迫综合征（NRDS），这种疾病也正是新生儿尤其是早产儿最致命的死亡病因．NRDS病发的关键机理在于因为新生儿机体内部缺少相关的肺泡表面活性物质（pulmonary surfactant，PS），从而使得机体肺泡的表面作用力变大，大量的肺泡出现塌症状．肺泡表面活性物质是由上皮细胞分泌的一种复杂的磷脂蛋白，它的主要功能就是对维护新生儿肺部呼吸能力并且使得肺泡的表层张力减小．从目前的研究结果可以看出，SP肺表面活性蛋白-B抗体的缺失与Respiratory Distress Syndrome（RDS）的发生息息相关［1］，然而上位基因的序列往往会调节控制蛋白的表达情况．本论文的目的主要是研究 SP肺表面活性蛋白-B抗体的异常与 RDS的发生情况的相关性，我们从基因以及蛋白两方面的标准选择我院从 2011-09／2013-09两年之内在新生儿监护病房（neonatal intensive care unit，NICU）治疗的死亡的 RDS病患，并分析研究其 SP-B的状况．

1 资料和方法

1．1 一般资料 选取我院 2011-09／2013-09入院的由于 RDS致死的新生儿病例 63例，命名为 RDS组，随后选取的对照组则为同一时期由于其他因素致死的63例新生的婴儿，其中死亡因素有肺部支气管先天发育不全、休克以及先天性心脏病等病症，以此同时，这些病例都与RDS组的各个方面相似，比如性别、重量、年龄、孕妇的生产时间以及分娩的手段等很多条件．

RDS组与对照组依照次序的先后，每组分别有21例病患，并将其归入胎龄小于等于 31周、胎龄为32～36周之间和胎龄大于等于 37周，并且符合患儿与患儿之间没有任何血缘关系的要求，家属知情同意尸检．

1．2 方法

1．2．1 肺组织取材 对研究的所需死亡的患儿均将其肺组织取出，时间限制在其死亡后的30 min之内．RDS组分别在死亡患儿的五叶肺部位切取肺部组织一小块，而在对照组的死亡病患随机的在肺部切取肺组织的其中一小块．在切取肺组织后的研究所需死亡的患儿应当将其马上浸没在多聚甲醛（4%）溶液中使其固化，再用石蜡包裹掩埋之后，连续切片 5 μm．

1．2．2 免疫印迹分析 SP-B蛋白在肺部的表达 肺组织将被研磨成碎片，与裂解缓冲液配制成1∶5的比例，在4℃的温度下，离心机中以12 000 r／min的转速离心1 h，将 SDS凝胶置于10 L的上清液并加入缓冲液然后对 SDS凝胶进行电泳实验，完成电泳步骤之后将其转移到了硝酸纤维素的薄膜之上，随后再用Tris-HCl缓冲溶液（TBS）Tween20进行洗涤，在3%浓度的牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）中封闭一小时，3%BSA与兔抗人SP-B多克隆抗体按照1 ∶3 000的比例进行稀释，随后酸纤维素膜将会被放置在溶液中，在 4℃的条件下放置过夜，将硝酸纤维素膜置于摇床上1×TBST的溶液中振动洗涤三次，碱性磷酸酶标示过的二抗性羊抗兔蛋白 IgG与TBST依据1∶5 000的比例进行稀释，与此同时，硝酸纤维素膜将会被置于内部，在室温条件下放置2 h，摇床均匀振动．

1．2．3 SP-BmRNA阳性细胞表示的定性以及定量准则 黄色显色剂二氨基联苯胺 DAB液着色之后，若有棕黄色的颗粒出现在胞浆中，则说明表达出的信号为杂交阳性，如果细胞的胞浆被着色染成棕黄的颜色则诊断其为 SP-BmRNA表现为阳性，随后采用四百倍的放大显微镜计算细胞的数量，每个大网格为1个视野，其是由一百个小格子构成．

1．2．4 SP-BmRNA缺失个体调查 SP-BmRNA相对标示量标准下限等于平均值减去两倍的标准偏差（x－2s），而 SP-BmRNA相对标示量比对照组标准下限的个体值更低，将其诊断为缺失SP-BmRNA．

1．3 统计学处理 使用 SPSS 13．0统计学软件分析患者资料，采用 t检验比较计数的资料，并以±s表示；两组内部的比较利用单因素方差进行研究，SP-B蛋白的缺失之间的比较应用配对四格表χ2进行统计，P＜0．05认为差异具有统计学意义．

2 结果

2．1 临床资料 患有RDS的新生儿在出生以后的0．5～6 h病发，临床症状表现为进行性持续的呼吸困难症状，血气数值显示出低氧血与高碳酸血症，诊断胸片确定为 III级和 IV级的呼吸窘迫综合征，在住院期间患儿采用猪肺磷脂一次又一次复诊，给药量为每次200 mg／kg，每天用药3～4次，都需要频率比较高的振动伴随着机械性的接通气体，患儿由于生病致使死亡或者由于经济拮据从而放弃对新生儿进行治疗，在出生后的两周之间死亡的 RDS患儿病症为 IV级者，大多数患儿在7 d之内由于患病而导致自然死亡．

2．2 肺部 SP-BmRNA表示阳性细胞的类比分析SP-BmRNA在对照组表示出的阳性细胞数（53．28± 10．74）要远远大于 RDS组（33．11±14．85），说明RDS组减小显著，差异具有统计学意义；而RDS组组中比较，胎龄增大，SP-BmRNA在肺部阳性细胞数表示没有随之而增多，然而相对于对照组，在胎龄增大情况下，肺部SP-BmRNA表达阳性的细胞数量随之显著增多．对于大于或者等于 32周的亚组，mRNA表示阳性细胞的数量，RDS组明显小于对照组；而在32～36周的亚组中，RDS组细胞数仍然小于对照组的细胞数量；在大于或者等于37周的亚组比较中，RDS组的细胞数量相对对照组显著减少．表 1为肺部SP-BmRNA阳性表达细胞数量在组间和组内以及亚组之间的比较．

表1 肺部SP-B mRNA阳性表达细胞子在组间以及组内亚组之间的比较

2．3 蛋白 SP-B以及 SP-BmRNA相对表示呈现的趋势 蛋白 SP-B在 RDS组缺失几率为14．29%，显著高于对照组的 1．59%，差异有统计学意义（P＜0．05），RDS组SP-BmRNA缺陷频率为42．86%，也显著高于对照组的7．94%．

3 讨论

过去的研究表明，呼吸窘迫综合征主要在早产儿身上发生，然而在新生儿诊疗技术越来越发达的当今，RDS的发生几率在足月儿身上也是逐年增高．近几年，世界顶尖研究以及相关的临床病症显示，多基因和许多复杂的原因是 RDS发病的主要因素，然而基因控制调节在 RDS的发病机理中可能占据了重要的功效．虽然 PS的混合物中 SP-B蛋白只是仅仅占了其中1%～2%的量，但是 SP-B蛋白仍然是确保正常呼吸的肺表面活性剂功效中最为重要的肺表面活性蛋白质，蛋白SP-B使得表面活性物质能在肺泡的气液介质上面快速伸展以及加快深入表面单独每一层的速率和确保表面活性物质功效的实施，使肺泡表面的作用力逐渐减小，从而防止肺泡的坍塌．与此同时，蛋白 SP-B还是构成肺和形成管状骨髓必须具备的一部分，构成这些部分必须有SP-C的加入．最近的调查显示，SP-B蛋白的基因遗传和 RDS在新生儿患者中阻塞性慢性肺气肿等病症息息相关，而且目前国内的研究已经逐渐开展并且也已经取得了初步良好的效果［2］，但蛋白 SP-B降低的发病因素我们还尚未研究清楚．人们对SP-B基因缺失越来越表现出理解的态度，并且渴望为新生儿相关病例的临床诊疗和治愈开辟更加广阔的学术新天地．

［1］尹晓娟，李丽华，王 艳，等．新生儿呼吸窘迫综合征患儿肺表面活性物质蛋白B表达的研究［J］．中国新生儿科杂志，2011，26：336－339．

［2］尹晓娟，谢 露，池 婧，等．SP-B遗传缺陷导致足月新生儿呼吸窘迫综合征3例［J］．中国新生儿科杂志，2011，26（4）：268．

The study of possible mechanism of surfactant protein B participate in neonatal respiratory distress syndrome

LU Fen
Department of Neonatology，First People's Hospital of Tancheng，Tancheng 276100，China

AIM：To explore the possible mechanism of the lung surface active substance protein B（SP-B）in neonatal respiratory distress syndrome（RDS）．METHODS：Selected from September 2011 to September 2013，63 cases of unrelated newborns dying of RDS were set as RDS group，of which there were 31 weeks or less group，32～36 weeks group and 37 weeks or more group，21 cases in each group；63 cases of newborn，unrelated，death from other diseases，were set as the control group，to match the gestational age with the RDS group at 1∶1．RESULTS：RDS group，lung SP-BmRNA positive cells number did not increase with the increase of gestational age，whereas the control lung SPBmRNA positive cells number increased with the increase of gestational age．SP-BmRNA positive expression cells in RDS group were obviously lower than the control group．Defect frequency of B protein in RDS group was 14．29%，significantly higher than the control group's 1．59%；RDS group's SP-BmRNA defect frequency was 42．86%，which was also significantly higher than the control group's 7．94%．CONCLUSION：SP-BmRNA defects involved in the pathogenesis of RDS．

respiratory distress syndrome；newborn；lung surface active substances protein B

2095-6894（2014）05-035-03

2014-05-22；接受日期2014-06-09

陆 芬．本科，副主任医师．研究方向：新生儿．Email：liuyilei88888＠163．com

R722．1

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