HSG/Mfn2和PCNA在人脑胶质瘤组织中的表达及意义

罗 卫 刘晓燕 方永军 张统帅 胡珍渊 张 毅 王更新

胶质瘤是常见的原发性脑肿瘤，5年生存率仅为35%～50%[1]，手术全切率低，术后复发率高，是神经外科的难题之一[2]，近年来，有关神经胶质瘤的基因治疗是研究的热点。增殖抑制基因(hyperplasia suppressor gene,HSG)是1种新近发现的与细胞增殖相关的信息传递分子，它对血管平滑肌细胞的增殖有抑制作用[3]。Santel等在肺组织中克隆出的线粒体融合蛋白2(mitochondrial fusion,Mfn2)基因核苷酸序列与HSG完全相同[4]，两者实为同1种基因。研究表明，HSG/Mfn2对多种肿瘤传代细胞系具有抗增殖和诱导凋亡的作用，而且该基因抗增殖作用明显大于肿瘤抑制基因p53[3]，提示HSG/Mfn2有可能是1种新的抑癌基因。目前该基因在乳腺癌、直肠癌、肝癌、肺癌等恶性肿瘤中均有相关研究，但在人脑胶质瘤中尚未见相关报道，本研究旨在探讨HSG/Mfn2与胶质瘤病理级别的关系。

1 材料与方法

1.1 标本来源

收集陕西中医学院附属医院神经外科、2007年1月至2012年12月手术切除的、55例脑胶质瘤石蜡标本。其中男性39例，女性16例，年龄22～75岁，平均(48±3.7)岁。以同期脑出血行减压术的10例正常脑组织标本作为对照。入选标准：①均以4%的多聚甲醛中性溶液固定，常规石蜡包埋；②均经HE染色或免疫组织化学染色明确诊断。按照2007年WHO中枢神经系统肿瘤分类标准：Ⅰ级14例(均为毛细胞型星形细胞瘤)；Ⅱ级13例(少突胶质细胞瘤4例、弥漫性星形细胞瘤9例)；Ⅲ级14例(间变性少突胶质细胞瘤3例、间变性星形细胞瘤5例、间变性少突星形细胞瘤6例)；Ⅵ级14例(髓母细胞瘤6例，胶质母细胞瘤8例)。患者术前均未行放疗、化疗或激素治疗。

1.2 试剂

兔抗人Mfn2多克隆抗体、羊抗兔IgG、鼠抗人PCNA单克隆抗体、山羊抗鼠IgG、SABC试剂盒、DAB显色试剂盒均来自武汉博士德公司。

1.3 免疫组织化学染色

采用链酶亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(streptavidin-biotin-complex,SABC)法进行免疫组化染色，分别检测肿瘤组织中PCNA和HSG/Mfn2蛋白的表达。一抗选用兔抗人Mfn2多克隆抗体和鼠抗人PCNA单克隆抗体，0.1%mmol/L的PBS溶液代替一抗作为阴性对照，以已知阳性片作为阳性对照，DAB显色，镜下控制反应时间，苏木精复染。

1.4 结果判定

以胞核或胞质出现棕黄色或棕褐色为阳性信号。每个标本至少切片6张，HSG/Mfn2及PCNA各染色3张，染色后在高倍镜下(×400)拍片，图片导入Image-Pro Plus6.0图像分析系统，计算每张切片阳性区域的平均光密度(Mean density,D)值和积分光密度(integrated optical density,IOD)值，作为评价阳性信号强弱的指标。

1.5 统计学方法

2 结果

PCNA阳性染色位于细胞核，为棕黄色或棕褐色颗粒状分布。正常脑组织中未见PCNA表达，55例胶质瘤组织中PCNA表达水平均较高，胶质瘤恶性程度越高，其阳性细胞比例越高，染色越深。HSG/Mfn2出现阳性染色时可见细胞核周围的胞质中有棕黄色或棕褐色颗粒。正常脑组织和胶质瘤组织中均可见HSG/Mfn2蛋白表达，不同病理级别的胶质瘤组织中HSG/Mfn2蛋白表达水平均明显低于正常脑组织，增殖活跃区域其阳性染色较弱，增殖相对不活跃区域染色较强，正常脑组织染色最强。定量分析结果显示，HSG/Mfn2蛋白表达阳性区域D值和IOD值随肿瘤恶性程度的增高逐渐减小，各组间比较差异有统计学意义(P<0.05) (表1)。

表1 两组中PCNA和HSG的表达情况

▽为与肿瘤组不同病理级别间比较，P<0.05;▲为与肿瘤组Ⅰ级与Ⅱ级比较，P<0.01。

3 讨论

PCNA位于细胞核内，是周期蛋白的1种，在细胞增殖的启动上起重要作用[5]，检测PCNA可客观反映细胞增殖特性，对判断肿瘤的分化和预后有重要的价值[6-7]。胶质瘤作为中枢神经系统最常见的神经上皮性肿瘤，具有极强的侵袭性和增殖活性，PCNA是作为肿瘤增殖相关研究中可靠的增殖性标志物之一，被认为与胶质瘤恶性进展密切相关[8]，也是预测脑胶质瘤是否复发的重要参考因素[9]。本研究表明，PCNA在胶质瘤组织中表达水平明显增高，且随肿瘤病理级别的增高而增高，这说明PCNA与肿瘤恶性程度有一定相关。

Chen等[3]研究认为，过表达HSG/Mfn2可以抑制血管平滑肌细胞及肿瘤细胞系的增殖。夏耘等[10]研究显示，HSG/Mfn2能抑制血管内皮生长因子，从而抑制内皮细胞的增殖与迁移，最终引起血管生成抑制而抑制肿瘤生长。郝文炯等[11]在SD大鼠尾状核注射C6细胞建立脑胶质瘤模型，检测胶质瘤中HSG的表达，结果发现胶质瘤中HSG的表达明显低于对照组，且随肿瘤生长时间的增加而降低。另有研究表明，HSG/Mfn2是1种新型的p53基因的诱导基因，具有抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡的作用[12]。目前，HSG/Mfn2和人脑胶质瘤关系的研究尚未见相关报道，本研究结果表明，胶质瘤组织中HSG/Mfn2蛋白的表达水平低于正常脑组织，且随着肿瘤病理级别的增高逐渐下降，正好与PCNA相反。该研究也间接提示，过表达HSG/Mfn2可能会抑制胶质瘤的发展，为恶性肿瘤的临床诊治提供一个新的参考指标。

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