电晕电场辅助5－Fu作用HeLa细胞的实验研究

李 光，周海越，孙迎春

（1.长春中医药大学药学院，吉林 长春 130117；2.东北师范大学物理学院，吉林 长春 130024）

0 引言

在自然界环境中电磁场以多种形式普遍存在于人们的生活中，雷电、各种无线信号、家用电器等都产生一定的电磁场.正常情况下，人体已经适应普遍存在的电磁场，但外加高强度的电磁场对生物会有一定的影响.经一定强度高压芒刺静电场预处理的大豆种子的发芽率明显提高［1］，并能有效提高玉米种子的发芽率［2］.一定强度范围的高压芒刺静电场作用于实验鼠，能够有效激发免疫细胞表面分子的表达［3］，抑制人肝癌细胞SMMC7721的生长［4］.

多年来化疗是治疗肿瘤的一个主要方法，但这种方法不能起到药到病除的效果.化疗的主要障碍是受药物浓度及药物毒性的限制，难以有足够高浓度的化疗药物进入肿瘤内部，若大大提高用药量，则副作用会极大增加，使人难以承受.并且，肿瘤细胞内自然表达耐药基常产生耐药性［5］.因此，很多研究人员尝试提高化疗药物的增敏性.已有研究表明，一定的电场会使细胞膜脂质双分子层形成瞬时微孔，能够瞬时增加细胞膜的通透性和膜的电导率［6］.当电场取消后，微孔会关闭，不会对细胞造成影响.电场中的肿瘤细胞膜出现的微孔能够增强细胞膜的通透性，即增强了细胞的吞噬能力，减小了细胞膜对外来分子的排斥，也就是说，电场强迫抗癌药物通过细胞膜进入细胞，从而有效提高化疗药物的细胞毒性［7－8］，另外，当给细胞施加一定强度的电场时，由于热效应，细胞内的温度会明显升高，这有利于抑制肿瘤细胞内耐药基因的表达［9］，从而降低肿瘤细胞对化疗药物的耐药性.本文以体外传代培养的Hela细胞为对象，探讨了电晕电场配合化疗药物5－Fu对人宫颈癌细胞HeLa的杀伤作用，发现电晕电场辅助化疗药物5－Fu能够有效地杀伤体外培养的HeLa.

1 材料和方法

1.1 细胞培养及分组

细胞培养：HeLa细胞（东北师范大学细胞与遗传研究所提供）培养在37℃和5%CO2细胞培养箱中，培养基为质量分数10%胎牛血清的RPMI 1640（Invitrogen Corporation）.取处于对数生长期的细胞，进行计数，调整细胞浓度至5×104个／mL，分别以1和0.1mL／孔接种于6孔和96孔培养板中继续培养.

分组：所有细胞分为Ⅰ和Ⅱ两部分（每部分为不同电压梯度处理组）.Ⅰ为单纯电场处理部分，Ⅱ为电场联合5－Fu处理部分.Ⅱ组细胞于次日加入5－Fu，最终浓度为1μg／mL，在培养箱培养3h后，两组细胞同时接受电场处理.

1.2 电场装置及设定的场强梯度

图1为电晕电场装置.其中：A为控制开关；B为静电高压电源（0～250kV）；C为Q3－V型高压静电表（量程为0～30kV）.上下极板均采用长方形的铝板，上极板固定等长度、等间距排列的金属钉作为芒刺，以产生电晕电场，下极板接地，芒刺尖端与下极板间距离为2.5cm，电场处理细胞时将细胞培养板放在下极板正中.两极板面积远大于培养板面积，故细胞培养板内部电场可视为均匀电场，且可忽略边缘效应.电压梯度为0，2，6，10，14kV，处理时间为30min／d，连续处理4d.

图1 电场装配图

1.3 MTT法检测细胞活性

将Ⅰ和Ⅱ组在96孔培养板中培养细胞，每孔加入20μL MTT（5mg／mL），继续培养4h，弃去上清液，每孔再加入150μL DMSO，充分溶解后，用酶标仪（λ490nm）测定吸光度（A值），每个电场作用样本设8个复孔.绘制吸光度曲线，用抑制率＝［（对照组A值－实验组A值）÷对照组A值］×100%来计算电场对细胞增殖的抑制率.

1.4 FCM检测细胞死亡率

用质量分数为0.25%的胰蛋白酶消化6孔培养板中细胞，离心，PBS洗涤2次，加入0.05mg／mL的150μL PI染液，4℃避光染色30min.用FACScan流式细胞仪（美国B－D公司）检测细胞死亡率，计算特异阳性细胞百分比.

1.5 统计学方法

采用非配对Student't检验，Origin软件处理数据.

2 实验结果

2.1 单纯电晕电场对HeLa细胞生长的影响

MTT检测结果显示，单纯电晕电场对HeLa细胞生长的影响具有双向性（见表1和图2）.与对照组相比，在U≤2kV时，电场的作用促进了细胞的生长，在2kV电压作用下，细胞活性是对照组的1.27倍，抑制率是为－27.0%，而在U≥6kV时，电晕电场对HeLa生长起到了抑制作用，在电晕电场电压达到14kV时，细胞HeLa的活性仅是对照组的54.9%，抑制率高达45.3%（P＜0.01），而且随着电场电压的增加，对HeLa细胞生长的抑制程度增强.

2.2 电晕电场联合5－Fu对HeLa细胞生长的影响

采用流式细胞仪检测电晕电场联合5－Fu作用的HeLa细胞结果见表2和图3.各强度电场联合药物处理组致使HeLa细胞的死亡率均多于单纯电场组（见表1）和单纯加药组（见表2中0kV组），且细胞死亡率随电场强度增加而增加，与单纯电场处理组不同的是细胞活性不具有刺激生长和抑制生长的双向性.

表1 单纯电晕电场对HeLa细胞生长抑制影响（，n＝8）

表1 单纯电晕电场对HeLa细胞生长抑制影响（，n＝8）

电压／kV抑制率／%0—2－27.06 5.610 22.41445.3

表2 FCM检测电晕电场联合5－Fu作用HeLa细胞的死亡率

图2 电场强度与A值关系

图3 场强与电晕电场联合5－Fu作用后细胞死亡率关系

3 结论

本文以体外培养的HeLa细胞为对象，检测了电晕电场与化疗药物联合应用及单独用药对细胞的生长的影响.结果表明：5－Fu联合电晕电场共同作用体外培养的HeLa细胞时，HeLa细胞的生长收到极大的抑制，细胞活性降低，而细胞死亡率增加，5－Fu联合电晕电场共同作用对细胞的杀伤力既高于单纯电晕电场的作用也高于单纯5－Fu的作用.提示电晕电场与抗癌药物联合使用时能产生比抗癌药物单独作用时更大的细胞毒性.

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［2］孙迎春，丁会，徐丽红，等.高压芒刺静电场预玉米种子发芽影响的实验研究［J］.东北师大学报：自然科学版，2006，38（1）：84－86.

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［4］孙迎春，严羚玮，金光辉，等.高压芒刺静电场对人肝癌细胞SMMC7721生长的影响［J］.中国医学物理学杂志，2005，22（1）：391－392.

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