黄芪多糖对过氧化氢诱导大鼠视网膜神经节细胞氧化损伤的保护作用

司俊康 郭俊国 唐 凯 杜宇翔 郭大东 王兴荣

2山东中医药大学眼科研究所

3山东中医药大学附属眼科医院

糖尿病视网膜病变（DR）是严重影响人们生活质量的主要致盲性眼病之一。DR的主要机制是高血糖造成的微血管病变，毛细血管功能障碍可以导致视网膜局部缺血缺氧以及由此引起的视网膜神经节细胞（retinal ganglion cell，RGC）的氧化应激损伤〔1-3〕。研究表明，通过药物干预可以抑制DR患者RGC的凋亡，从而改善患者的视功能〔4〕。黄芪多糖（astragalus polysaccharide，APS）是从黄芪中提取的主要活性成分，具有抗氧化、调节免疫、调节血糖等作用。有学者发现黄芪多糖对于体外培养的乳鼠心肌细胞具有抗氧化保护作用〔5〕，但是其对体外培养的视网膜神经节细胞是否具有抗氧化保护作用尚不清楚。本实验通过观察黄芪多糖对过氧化氢诱导的大鼠RGC细胞氧化损伤的保护作用，为黄芪多糖及黄芪类药物治疗DR提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

传代培养的RGC细胞株RGC-5由吉林大学白求恩第二医院眼科医院惠赠。RGC-5置于含10%胎牛血清（FBS）（美国 Hyclone公司)，1 g/L 葡萄糖和谷氨酰胺，100 U/ml青霉素，100 U/ml链霉素的 Dulbecco改良 Eagle培养液（DMEM）（美国 Hyclone公司）的培养瓶中，于体积分数5%CO2、37℃的细胞培养箱中进行培养；隔夜换液，然后取对数生长期的细胞用于实验。 配制含 250 μg/ml、500 μg/ml、1 000 μg/ml黄芪多糖（西安奥泽生物科技有限公司）的DMEM高糖培养液；胰蛋白酶冻干粉（含EDTA）（美国Sigma公司）。流式细胞仪（美国BD公司），倒置相差显微镜（日本 OlympusⅨ71，日本 Olympus公司），酶联免疫检测仪（美国伯腾仪器有限公司），实时细胞电子分析系统（xCELLigence System，瑞士Roche公司），Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒（碧云天生物公司），噻唑蓝（MTT）（美国 Sigma 公司），4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，美国 Sigma公司）。

1.2 实验分组

RGC-5细胞分为正常对照组、阴性对照组、过氧化氢损伤组、黄芪多糖干预组。正常对照组不做任何处理，阴性对照组和过氧化氢损伤组分别加入1 000 μg/ml的黄芪多糖和100 μmol/L的过氧化氢，黄芪多糖干预组在加入不同剂量浓度（1 000 μg/ml、500 μg/ml、250 μg/ml）黄芪多糖孵育 12 h 后加入 100 μmol/L的过氧化氢作用24 h，然后用倒置相差显微镜观察各组细胞形态变化。

1.3 MTT法检测细胞活性

采用MTT比色法检测RGC-5细胞的活性。取处于对数生长期的RGC-5，接种于96孔板，1×104个/L。按各个分组的要求处理后，每孔加入5 mg/ml的 MTT溶液 20 μL，孵育4 h，然后弃掉上清，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）溶液 150 μl，低速振荡 10 min，选择490 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光密度，细胞活性以相对于正常对照组的百分比表示。

1.4 DAPI染色

应用DAPI染色观察各组细胞核形态学变化。取处于对数生长期的RGC-5细胞，接种于6孔板，1×104个／L。按各组要求处理后，每孔用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤2次，每孔加入4%的多聚甲醛固定液固定15 min，然后加入5 μg/ml的DAPI染色液室温作用15 min。在倒置相差显微镜下观察并记录实验结果。

1.5 实时细胞电子分析（RT-CES）

应用RT-CES系统监测各组细胞的生长的动态信息。RT-CES是基于检测电子传感器阻抗变化以反映细胞生理状态的新型细胞分析系统。在RTCES系统中，传感器培养板的底部有特殊的传感器阵列，靶细胞可以直接生长在传感器表面，造成传感器阻抗的变化，从而实时记录靶细胞的生长状态。在RT-CES 系统中，应用细胞指数（cell index，CI）来反映细胞的生长状态〔6〕。将RGC-5细胞接种于16孔的RT-CES传感器培养板上，密度1×104个/L，在培养箱中培养过夜，24 h后按上述实验分组处理，记录处理后72 h内的细胞生长状态。

1.6 统计学方法

应用SPSS 17.0统计软件进行统计分析，实验数据资料以均数±标准差表示，各样本经Levene检验总体方差相等，采用单因素方差分析，各组间的两两比较采用LSD检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 倒置相差显微镜下各组细胞形态

正常生长的RGC-5细胞呈扁平梭形，细胞透亮，边缘清晰，有较短突起，随着细胞生长，突起相互连接（图1A）。过氧化氢损伤组RGC-5细胞皱缩，细胞密度减低，轴突缩短（图1C）。其他各组RGC-5细胞形态变化不大，仅见少量细胞皱缩（见图1B，图1D～图 1F）。

图1 各组RGC-5细胞倒置荧光显微镜像。1A.正常对照组；1B.阴性对照组；1C.过氧化氢损伤组；1D.1 000 μg/ml干预组；1E.500 μg/ml干预组；1F.250 μg/ml干预组。正常生长的RGC-5细胞呈扁平梭形，细胞透亮，边缘清晰，有较短突起，随着细胞生长，突起相互连接。过氧化氢损伤组RGC-5细胞皱缩，细胞密度减低，轴突缩短。其他各组RGC-5细胞形态未见明显改变（×200倍）RGC：视网膜神经节细胞

2.2 MTT检测

阴性对照组、过氧化氢损伤组以及1 000 μg/ml、5 00 μg/ml、250 μg/ml的黄芪多糖干预组的细胞活性分别为（98.17±1.06）%、（64.22±2.10）%、（88.14±2.62）%、（81.51±1.48）%、（78.37±1.64）%。 与正常对照组相比，过氧化氢损伤组RGC-5细胞的活性明显降低（P＜0.01）。 与过氧化氢损伤组相比，1 000 μg/ml、500 μg/ml、250 μg/ml浓度的黄芪多糖干预组的细胞活性明显升高（P＜0.01）（图 2）。

图2 各组RGC-5细胞活性检测结果。A.正常对照组；B.阴性对照组；C.过氧化氢损伤组；D.1 000 μg/ml干预组；E.500 μg/ml干预组；F.250 μg/ml干预组 RGC：视网膜神经节细胞

2.3 DAPI染色

正常对照组（图 3A）和阴性对照组（图 3B）RGC-5细胞核核型完整，细胞核淡染，染色质均匀，未见明显凋亡表现；过氧化氢损伤组（图3C）RGC-5细胞核发生形变，可见染色质凝聚，边缘化；各个浓度干预组（图3D～图 3F）的RGC-5细胞核基本完整，少量细胞可见染色质浓缩现象。

2.4 实时细胞电子分析（RT-CES）

图4反映了不同分组细胞的生长状态。从图中可以看出，与正常对照组（曲线a）和阴性对照组（曲线b）相比，过氧化氢损伤组（曲线f）RGC-5细胞的生长明显受到抑制。与过氧化氢组相比，不同浓度黄芪多糖干预组（曲线c、d、e）RGC-5细胞的细胞指数有所上升。

3 讨论

近年来，视网膜神经节细胞凋亡与氧化应激机制的研究越来越多。氧化应激机制认为，细胞内氧化代谢产物积累导致细胞毒性损伤，从而造成细胞凋亡〔7-8〕。应用过氧化氢损伤模拟体内环境中细胞的氧化应激状态，已经为众多的实验所证实〔9-14〕。本实验在过氧化氢诱导RGC-5细胞氧化损伤的基础上观察黄芪多糖对RGC-5细胞的保护作用，从而探讨黄芪多糖保护视网膜神经节细胞的作用机制，并为黄芪多糖的临床应用提供实验基础。

图3 各组RGC-5细胞DAPI染色图像。3A.正常对照组；3B.阴性对照组；3C.过氧化氢损伤组；3D.1 000 μg/ml干预组；3E.500 μg/ml干预组；3F.250 μg/ml干预组。正常对照组和阴性对照组RGC-5细胞核核型完整，细胞核淡染，染色质均匀，未见明显凋亡表现；过氧化氢损伤组RGC-5细胞核发生形变，可见染色质凝聚，边缘化；各个浓度干预组的RGC-5细胞核基本完整，少量细胞可见染色质浓缩现象（×200倍）RGC：视网膜神经节细胞

图4 实时细胞电子分析。a.正常对照组；b.阴性对照组；c.1000μg/ml干预组；d.500 μg/ml干预组；e.250 μg/ml干预组；f.过氧化氢损伤组。与正常对照组相比，阴性对照组和各个浓度黄芪多糖干预组呈现正常的细胞生长曲线，过氧化氢损伤组细胞生长明显受到抑制

黄芪是临床上常用的补气类药物，在糖尿病及糖尿病视网膜病变和糖尿病肾病中应用较多。循证医学证据也证实了黄芪类药物对于糖尿病治疗的有效性〔15〕。黄芪多糖是黄芪中提取的有效成分，具有增强心肌收缩力、扩张冠状动脉、保护心肌细胞、改善心肌功能的作用，此外还有清除自由基、改善微循环、调节免疫等多种有益的生物学效应〔16-19〕。动物实验证实，黄芪多糖对于周围神经损伤的功能恢复具有促进作用，而且在损伤早期即可发挥作用〔20〕。

在本实验中，我们用过氧化氢诱导体外培养的RGC-5细胞氧化损伤，应用不同浓度的黄芪多糖干预保护，发现黄芪多糖干预组的细胞活性及细胞凋亡的数量较单纯过氧化氢损伤组有明显的逆转，证实了黄芪多糖对过氧化氢诱导的RGC-5细胞氧化损伤的保护作用，提示黄芪多糖对于糖尿病视网膜病变等疾病中视网膜神经节细胞的损伤可能有一定的保护作用，黄芪多糖可能是黄芪类药物治疗糖尿病视网膜病变的有效成分之一。鉴于体外培养的RGC-5细胞与活体内的视网膜神经节细胞有一定差别，对各种损伤的反应也可能会有所不同，所以黄芪多糖对于糖尿病视网膜病变RGC的保护作用及其在临床上的治疗效果和具体应用还有待进一步研究。

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