中国北方汉族人群VANGL1、FZD3和FZD6基因交互作用与神经管缺陷的关系

石鸥燕，蔡春泉，黎小沛，孙 伟，沈永明

(1.天津医科大学 基础医学院， 天津 300070； 天津市儿童医院 2.外科； 3.检验科， 天津 300074)

中国北方汉族人群VANGL1、FZD3和FZD6基因交互作用与神经管缺陷的关系

石鸥燕1，蔡春泉2*，黎小沛1，孙 伟1，沈永明3

(1.天津医科大学 基础医学院， 天津 300070； 天津市儿童医院 2.外科； 3.检验科， 天津 300074)

目的探讨VANGL1、FZD3和FZD6基因单核苷酸多态性(SNPs)位点间的交互作用对中国北方汉族人群神经管缺陷(NTDs)患病风险的影响。方法选取VANGL1基因2个SNPs(rs4 839 469和rs34 059 106)，FZD3基因2个SNPs(rs2 241 802和rs28 639 533)以及FZD6基因3个SNPs(rs827 528、rs3 808 553和rs12 549 394)，采用PCR扩增和测序的方法对135例NTDs患者和135例正常对照者进行基因分型，使用多因子降维法软件(MDR)分析基因-基因交互作用。结果VANGL1基因rs4 839 469位点基因型分布在病例组与对照组之间有差异 (Plt;0.05)，FZD6基因rs3 808 553位点基因型分布在病例组与对照组之间有差异 (Plt;0.05)；MDR分析结果显示VANGL1、FZD3和FZD6基因交互作用存在于两位点模型(rs4 839 469-rs3 808 553)(OR=3.18，95% CI:1.85～5.44；χ2=18.39，Plt;0.0001)，3位点模型(rs4 839 469-rs2 241 802-rs3 808 553)(OR=4.17，95% CI:2.43～7.14；χ2=28.5，Plt;0.0001)以及4位点模型(rs4 839 469-rs2 241 802-rs827 528-rs3 808 553)(OR=7.34，95% CI:3.98～13.54；χ2=45.3，Plt;0.0001)。结论VANGL1、FZD3和FZD6基因存在交互作用，并可能增加NTDs的发病风险。

VANGL1；FZD3；FZD6；基因-基因交互作用；神经管缺陷

神经管缺陷(neural tube defects, NTDs)是一类常见的出生缺陷，是由于胚胎发育过程中神经管闭合不全所引起，临床上主要表现为无脑畸形、脑膜/脑膨出、脊柱裂、脊髓脊膜膨出等[1]。研究证实NTDs是多因素相关疾病，是遗传和环境因素共同作用的结果。最近国内外研究证实了VANGL1基因与NTDs存在高度相关性[2-4]，中国北方汉族人群VNAGL1基因存在Ala116Pro变异，变异后其所处的α螺旋结构片段明显缩短[5]。FZD3和FZD6基因在最近的研究中也发现与NTDs相关联[6-7]。那么同是PCP信号通路中的核心基因，VANGL1在NTDs发病过程中的作用是否与FZD3/6相关联？本研究中，通过单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)位点间基因交互作用分析，对VANGL1基因和FZD3/6基因与NTDs的关系进行深入探讨。

1 材料与方法

1.1 研究对象

135例NTDs患儿为2003年11月至2010年8月天津市儿童医院神经外科收治的患儿，结合患儿症状、体征、影像学资料及手术所见做出NTDs诊断。135例对照组血液样本来自与病例组年龄、性别构成相仿的罹患颅脑外伤患者(根据症状、体征及影像学结果，均除外NTDs)。全部NTDs患儿母亲均于围孕期有补充叶酸制剂经历，且入组病例为在中国华北、西北及东北省份长期居住及生活的汉族家庭。以上标本的收集均获得患儿家属知情同意和医学伦理委员会的同意。

1.2 基因组DNA提取与鉴定

分别取患儿及对照组血液2 mL，枸橼酸钠抗凝，采用DNA试剂盒(北京天根公司)提取基因组DNA，操作按试剂盒说明进行，-80℃储存备用。

1.3 SNPs选取

直接检索dbSNP数据库(build130)，并结合SNPper检索软件，选取两者检索结果中共有的基因编码区错义SNP，得到VANGL1基因2个SNPs(rs4 839 469和rs34 059 106)，FZD6基因3个SNPs(rs827 528、rs3 808 553和rs12 549 394)，由于FZD3基因没有得到共有的编码区错义SNP，因此选取了该基因2个编码区同义SNPs (rs2 241 802和rs28 639 533)。

1.4 PCR反应

待测SNP位点PCR引物(表1)，由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。

表1 待测SNPs的PCR引物信息Table 1 The Primer sequence of loci for VANGL1,FZD3 and FZD6

PCR反应体系为：10×Ex Taq缓冲液2.5 μL，dNTP 2 μL，正反义引物各0.3 μL，模板DNA 2 μL，Ex Taq 0.2 μL，水17.7 μL。反应条件：94 ℃预变性5 min，35个循环(94 ℃ 40 s，56 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s)，72 ℃ 10 min，12 ℃保存。

1.5 测序反应

测序反应条件：95 ℃变性2 min后进行PCR循环，PCR循环参数为95 ℃ 15 s, 50 ℃ 15 s，60 ℃ 90 s，35个循环, 扩增结束后设置12 ℃保温。分析出测序图谱(北京六合华大基因)。

1.6 统计学分析

Hardy-Weinberg遗传平衡检测样本是否符合孟德尔遗传规律，所用软件为hwe(http://www.biology.ualberta.ca/jbrzusto/hwenj.html)。SNP分型数据输入SPSS 13.0软件，采用卡方检验或Fisher精确检验比较各基因型在病例组和对照组间的构成比差异。使用多因子降维法(multifactor dimensionality reduction, MDR)2.0软件包计算基因-基因交互作用。

2 结果

2.1 Hardy-Weinberg平衡检验

病例组和对照组7个多态性位点的基因型频率均符合Hardy-Weinberg平衡定律(Pgt;0.05)。

2.2病例组与对照组间各SNPs位点的基因型分布

2个SNPs位点未检测出多态性结果，分别为VANGL1基因rs34 059 106和FZD3基因rs28 639 533，因此对这两个SNPs位点未做进一步统计学分析。

VANGL1基因rs4 839 469和FZD6基因rs3 808 553的基因型分布在病例组与对照组之间有差异 (Plt;0.05)(表2)。由于测序实验中存在测序结果低质量，所以表2中每个位点的病例数不同。

2.3VANGL1、FZD3和FZD6基因MDR最优模型与NTDs的关系

MDR软件给出的交互作用最优模型为VANGL1 rs4 839 469-FZD6 rs3 808 553、VANGL1 rs4 839 469-FZD3 rs2 241 802-FZD6 rs3 808 553、VANGL1 rs4 839 469-FZD3 rs2 241 802-FZD6 rs827 528-FZD6 rs3 808 553(表3)，其与NTDs均存在显著性关联(Plt;0.001)。由此提示VANGL1、FZD3与FZD6基因之间的交互作用能够显著增加NTDs的发生风险。

表2 VANGL1、FZD3和FZD6基因型在病例组与对照组中的分布Table 2 Genotype frequencies of loci for VANGL1, FZD3 and FZD6

*Plt;0.05 compared with control group.

表3 多因子降维分析结果汇总Table 3 MDR models of VANGL1, FZD3 and FZD6

X1-X5 are used to represent rs4839469, rs2241802, rs827528, rs3808553 and rs12549394.

3 讨论

近年来研究表明，疾病的发生与多个遗传位点多态性的联合作用有关，即存在基因-基因之间的交互作用。MDR[8]是一种非参数多因素交互作用分析方法，以疾病易感性(高危、低危)分类，将研究中的多个因子看作一个多因子组合，这样可把高维结构降低到一维两水平(即高危或低危)，实现“降维”。MDR应用于病例对照研究进行基因-基因交互作用分析明显优于传统统计分析方法。该软件可从网上免费下载(http://sourceforge.net/projects/mdr/)。

孕妇叶酸缺乏对NTDs发生起着重要作用[9]，但围孕期孕妇补充叶酸制剂可使NTDs发生率降低50%～70%，仍不能完全预防其发生[10]，因此可能存在其他与NTDs发生相关联的病因途径。而研究表明，神经管形成过程与定向细胞分裂和定向诱导迁移有着直接的关联，其中关键性的作用因素之一就是平面细胞极性(planar cell polarity, PCP)信号通路的调节[11]。在PCP信号通路中，以VANGL和FZD基因对神经管形成作用的影响最为明确[2-7]。

人类VANGL1和VANGL2基因染色体定位分别位于1p11-p13.1和1q22-q23，VANGL1全长56 kb，编码524个氨基酸；VANGL2全长28 kb，编码521个氨基酸。

人类FZD基因包括FZD1-FZD10共10个成员，其中以FZD3和FZD6对神经管形成作用的影响较为明确[6-7]。FZD3染色体定位在8p21，全长70 kb，编码666个氨基酸；FZD6染色体定位在8q22.3-q23.1，全长34 kb，编码706个氨基酸。

FZD和VANGL作为两个跨膜蛋白，在细胞间信号传导方面均起着关键性作用。FZD和VANGL互相把对方募集到相邻细胞的交界对面[12]，这个过程是由微弱的不平衡引导的。在克隆细胞中的FZD和VANGL两者之间任何一方缺失，都将留下不平衡的相互作用，并给其相邻的细胞带来异常的信号。本研究通过基因-基因交互作用分析显示VANGL1、FZD3和FZD6基因存在明显的正交互危险效应，这就从基因水平上支持了VANGL与FZD之间存在相互作用的观点。

综上所述，本研究通过多因子降维法分析，发现中国北方汉族人群中VANGL1、FZD3和FZD6存在基因-基因交互作用，可能增加了NTDs的发病风险。由于时间、经费所限，对基因-基因之间的交互作用进行了初步的研究，有待于更进一步扩大样本和深入研究。

[1] Greene ND, Stanier P, Copp AJ. Genetics of human neural tube defects[J]. Hum Mol Genet, 2009, 18: 113-129.

[2] Kibar Z, Torban E, McDearmid JR,etal. Mutations in VANGL1 associated with neural-tube defects[J]. N Engl J Med, 2007, 356:1432-1437.

[3] Kibar Z, Bosoi CM, Kooistra M,etal. Novel mutations in VANGL1 in neural tube defects[J]. Hum Mutat, 2009, 30: 706-715.

[4] 徐织,王剑,傅启华,等.中国人群神经管缺陷VANGL1基因突变的筛查及关联研究[J]. 临床小儿外科杂志, 2011, 10:94-97.

[5] 蔡春泉,石鸥燕,管卫,等. VANGL1基因多态性与中国北方汉族人群神经管发育缺陷的相关性[J].中华小儿外科杂志,2013,34:10-13.

[6] Wang Y, Guo N, Nathans J. The role of Frizzled3 and Frizzled 6 in neural tube closure and in the planar polarity of inner-ear sensory hair cells[J]. J Neurosci, 2006, 26:2147-2156.

[7] De Marco P, Merello E, Rossi A,etal. FZD6 is a novel gene for human neural tube defects[J]. Hum Mutat, 2012,33:384-390.

[8] Ritchie MD, Hahn LW, Roodi N,etal. Multifactor-dimensionality reduction reveals high-order interactions among estrogen-metabolism genes in sporadic breast cancer[J]. Am J Hum Genet, 2001, 69:138-147.

[9] 李竹,李松,王红,等.中国妇女妊娠前后单纯服用斯利安叶酸片对神经管畸形的预防效果[J].中华医学杂志, 2000, 80: 377-379.

[10] van der Linden IJ, Afman LA, Heil SG,etal. Genetic variation in genes of folate metabolism and neural-tube defect risk[J]. Proc Nutr Soc, 2006, 65:204-215.

[11] Wang Y, Nathans J. Tissue/planar cell polarity in vertebrates: new insights and new questions[J]. Development, 2007, 134: 647-658.

[12] Strutt D, Strutt H. Differential activities of the core planar polarity proteins during Drosophila wing patterning[J]. Dev Biol, 2007,302:181-194.

Gene-gene interactions amongVANGL1，FZD3 andFZD6 are associated with neural tube defects in Han population of northern China

SHI Ou-yan1, CAI Chun-quan2*, LI Xiao-pei1, SUN Wei1, SHEN Yong-ming3

(1.School of Basic Medical Sciences, Tianjin Medical University, Tianjin 300070;2.Dept. of Surgery; 3.Dept. of Clinical Laboratory, Tianjin Children’s Hospital, Tianjin 300074, China)

ObjectiveTo identify the impact of gene-gene interaction amongVANGL1,FZD3 andFZD6 on the risk of neural tube defects in Han population of northern China.MethodsTwo SNPs (rs4 839 469 and rs34 059 106) withinVANGL1, two SNPs (rs2 241 802 and rs28 639 533) withinFZD3 and three SNPs(rs827 528, rs3 808 553 and rs12 549 394) withinFZD6 were genotyped in 135 NTD patients and 135 healthy controls．The gene-gene interaction amongVANGL1,FZD3 andFZD6 was analyzed by Multifactor Dimensionality Reduction software.ResultsThe frequency of genotypes of rs4 839 469 withinVANGL1 and rs3 808 553 withinFZD6 was significantly higher in patients than that in controls(Plt;0.05)．MDR revealed that the significance were shown in patterns with 2 SNPs (rs4 839 469-rs3 808 553)(OR=3.18，95% CI:1.85～5.44；χ2=18.39，Plt;0.0001)，3 SNPs(rs4 839 469-rs2 241 802-rs3 808 553) (OR=4.17，95% CI:2.43～7.14；χ2=28.5，Plt;0.0001)and 4 SNPs(rs4 839 469-rs2 241 802-rs827 528-rs3 808 553) (OR=7.34，95% CI:3.98～13.54；χ2=45.3，Plt;0.0001).ConclusionsThe gene-gene interaction amongVANGL1,FZD3 andFZD6 may increase the risk of NTDs.

VANGL1;FZD3;FZD6; gene-gene interaction; neural tube defects

2013-05-23

2013-09-24

国家重点基础研究发展计划(973计划)(2013CB945404)；天津市卫生行业重点攻关项目(12KG116)；天津市卫生局科技基金(2011KZ87)

*通信作者(correspondingauthor)： tjpns@126.com

1001-6325(2014)03-0301-04

研究论文

R726

A