Nrf2减轻小鼠非酒精性脂肪性肝炎

张海峰， 王 锋，曹 戬

(1.内蒙古医科大学 基础医学院 生理教研室， 内蒙古 呼和浩特 010110； 2.中国中医科学院 广安门医院 病理科， 北京 100053)

Nrf2减轻小鼠非酒精性脂肪性肝炎

张海峰1*， 王 锋1，曹 戬2

(1.内蒙古医科大学 基础医学院 生理教研室， 内蒙古 呼和浩特 010110； 2.中国中医科学院 广安门医院 病理科， 北京 100053)

目的研究Nrf2对小鼠非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的作用及其可能机制。方法通过蛋氨酸-胆碱缺乏饲料(MCD)饲喂小鼠获得NASH模型；随机分为对照组、模型组以及Nrf2组，Nrf2组灌胃姜黄素0.9 mL/d，对照组和模型组给予相应体积的0.9%氯化钠注射液灌胃。4周后检测肝组织中Nrf2含量，肝指数，血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶水平(AST)、葡萄糖(GLU)、三酰甘油(TG)和胆固醇(Chol)含量；对肝脏进行油红O染色；检测肝组织中TG、Chol、丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)含量及超氧化物歧化酶(SOD)的活性；并检测细胞色素C和ATP含量。结果与模型组小鼠相比，Nrf2组小鼠的血清中ALT，AST和GLU含量下降 (Plt;0.05)，肝组织中TG、Chol和MDA含量下降(Plt;0.05)，GSH水平、SOD活性升高(Plt;0.05)；同时细胞色素C漏出降低，ATP含量上升(Plt;0.05)。结论Nrf2对由蛋氨酸-胆碱缺乏所引起的NASH具有一定的保护作用，其机制可能是通过减少氧化应激，提高线粒体活性实现的。

转录因子E2相关因子2；非酒精性脂肪性肝炎；蛋氨酸-胆碱缺乏饲料；氧化应激

非酒精性脂肪型肝炎(non-alcoholic steatohepatitis, NASH)是非酒精性脂肪性肝病的一种病理分型，由于其患病人数较多，因此越来越多的受到人们的重视。转录因子E2相关因子2(nuclear factor-erythroid 2 related factor 2, Nrf2)几乎存在于机体各个细胞，不仅与机体的防御系统密切相关，而且是细胞防御氧化应激的重要调节因子[1-2]。同时 Nrf2的表达与谷丙转氨酶(alanine aminotransferase, ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase, AST)的水平成正相关[3]，这提示Nrf2在NASH中起到重要作用。文献研究表明，姜黄素可以诱导肝脏分泌Nrf2[4]。因此，本实验采用姜黄素诱导小鼠肝脏分泌Nrf2，并用蛋氨酸-胆碱缺乏饲料(methionine choline-deficient, MCD)制备NASH模型，旨在探讨Nrf2在NASH中的保护作用及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物和饲料: 野生型SPF级C57BL/6小鼠30只, 6周龄, 雄性，体质量为20～25 g，北京维通利华实验动物技术有限公司(J 2011-0011)。MCD配方[5]由北京华阜康生物技术股份有限公司制作；正常饲料购买于北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.1.2 主要试剂: 抗Nrf2兔抗鼠多克隆抗体(Abcam公司)，细胞色素C抗体 (Santa Cruz公司)、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔(北京中杉金桥生物技术有限公司)；Western blot超敏发光液、游离脂肪酸超敏测定试剂盒、组织细胞总胆固醇酶法测定试剂盒、三酰甘油测定试剂盒、丙二醛(malonaldehyde, MDA)试剂盒、ATP检测试剂盒、GSH 试剂盒和SOD 活性检测盒(北京蒂诺奥基因技术有限公司)；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 模型制备及分组

将小鼠饲喂普通饲料适应性饲养1周后随机分成: 对照组(control组)、模型组(MCD组)和Nrf2组(MCD+curcumin组)，每组10只。模型组与Nrf2组饲喂MCD饲料，MCD+curcumin组用姜黄素以0.9 mL/d剂量灌胃[6], 实验动物均自由摄食、饮水。

1.3 取材

饲喂4周后，禁食水12 h，称体质量，4%水合氯醛麻醉，下腔静脉取血，分离血清，-80 ℃保存；肝脏称重后部分液氮冻存，部分4%多聚甲醛固定。

1.4 指标检测

1.4.1 一般情况：观察各组小鼠行为活动、体形及毛发状态。称取体质量和肝湿重，计算肝指数[肝指数(%)=肝脏质量(g)/体质量(g)×100%]。

1.4.2 肝组织病理学检测：取小鼠肝脏组织用于油红O染色和HE染色。

1.4.3 血清学检测：下腔静脉取血获取血清，保存于-80 ℃冰箱中。血清ALT、AST、TG和Chol采用全自动生化分析仪测定。用 MDA 试剂盒、GSH 试剂盒、SOD 活性检测盒检测相应指标。

1.4.4 测定肝组织TG，FFA，Chol含量：精确称取0.5 mg肝组织，按照TG，FFA，Chol测定试剂盒及ATP检测试剂盒说明书进行检测。

1.4.5 Western blot法检测蛋白水平：取0.5 mg肝组织，用RIPA裂解液提取总蛋白,用BCA定量法测定样品的浓度, 取适量样品进行SDS-PAGE。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 给予姜黄素干预后，肝脏中Nrf2的表达变化

给予姜黄素干预后，发现MCD+curcumin组中肝脏Nrf2表达含量明显升高(Plt;0.05)(图1)。

*Plt;0.05 compared with control group图1 Western blot检测Nrf2蛋白质水平Fig 1 Quantification of Nrf2 by Western blot(n=5)

2.2肝脏诱导Nrf2后可以减轻由MCD引发的小鼠体质量下降和肝指数下降

对照组小鼠体毛整齐，有光泽，体质量正常且稳步增长, 其摄食量和饮水量也正常，垫料干燥。和对照组小鼠相比，模型组小鼠体毛凌乱，精神萎靡，进食量明显下降, 进水量上升，垫料潮湿。而使用姜黄素诱导Nrf2组的小鼠体质量减轻，精神良好，进食量无明显下降。模型组与对照组小鼠相比，体质量、肝湿重和肝指数均有所下降 (Plt;0.05)；而在使用姜黄素诱导Nrf2组小鼠与模型组小鼠相比，体质量、肝湿重和肝指数均显著升高 (Plt;0.05) (表1)。

2.3 肝组织形态学改变

对照组小鼠肝组织中肝窦清晰可见，肝索排列整齐，形态结构正常。组织内未出现红色脂滴。模型组小鼠肝细胞内出现大量大小不一的脂肪空泡，肝细胞结构紊乱，肝小叶内出现多淋巴细胞浸润，可见到大量红色脂滴，约为60%～75%。而姜黄素诱导Nrf2组小鼠肝细胞出现部分空泡，少部分区域出现肝索结构紊乱，偶见炎性细胞浸润，红色脂滴含量较少，约为15%～20%，其病变程度远低于模型组(图2A)。且姜黄素诱导Nrf2组小鼠肝脏病理评分低于模型组 (Plt;0.05) (图2B)。

表1 各组小鼠的体质量、肝脏湿重和肝脏指数Table 1 Body weight, Liver wet weight and Hepatic index of mice in each group(±s，n=10)

*Plt;0.05 compared with control group;#Plt;0.05 compared with MCD group.

2.4 血清ALT、AST、GLU、Chol、TG结果

模型组小鼠血清中ALT、AST水平均高于对照组小鼠(Plt;0.05)，其血清Chol、TG、GLU的含量均低于对照组 (Plt;0.05)；与模型组相比，姜黄素诱导Nrf2组血清中ALT、AST水平明显降低(Plt;0.05)；血清中Chol、TG、GLU含量则明显升高(Plt;0.05) (表2)。

表2 各组小鼠血清中的ALT、AST、GLU、Chol和TG水平Table 2 The level of ALT, AST, GLU, Chol and TG in serum of each group mice(±s，n=10)

*Plt;0.05 compared with control group;#Plt;0.05 compared with MCD group.

2.5 肝组织中Chol、TG、FFA含量

与空白对照组小鼠相比，模型组小鼠肝组织中Chol、TG、FFA含量均有明显增高(Plt;0.05)；Nrf2组小鼠与模型组小鼠相比，肝组织中Chol、TG、FFA含量降低(Plt;0.05)(表3)。

表3 各组小鼠肝组织中Chol、TG、FFA的水平Table 3 The levels of Chol, TG and FFA in liver of each

*Plt;0.05 compared with control group;#Plt;0.05 compared with MCD group.

2.6 肝组织氧化应激指标的检测

与空白对照组小鼠相比，模型组小鼠肝组织中MDA含量有所升高(Plt;0.05)，而GSH含量及 SOD活性均明显降低(Plt;0.05)； Nrf2组小鼠与模型组小鼠相比，肝组织中MDA含量降低，但GSH含量及SOD活性明显增加(Plt;0.05)(表4)。

2.7 线粒体功能指标检测

与空白对照组小鼠相比，模型组小鼠肝组织中细胞色素C漏出增多，ATP含量降低(Plt;0.05)

表4 各组小鼠肝组织中MDA、GSH和SOD的水平Table 4 The levels of MDA, GSH and SOD in liver of

*Plt;0.05 compared with control group;#Plt;0.05 compared with MCD group.

(图3B)； Nrf2组与模型组相比，小鼠肝组织中细胞色素C漏出减少(图3A)，ATP含量升高(Plt;0.05)。

3 讨论

MCD饲料是营养缺乏性饲料，是目前国际上公认的作为研究NAFLD中炎性反应及纤维化最好的动物模型之一[7]。正常小鼠饲喂MCD饲料后，脂质会在小鼠肝细胞内堆积。其病症特点为伴有胰岛素抵抗，消瘦，无血脂异常，血清学TG水平降低，体重下降明显，并伴有肝质量及肝指数下降[7]。

本实验首先通过饲喂MCD饲料成功建立了NASH模型。在NASH进程中，氧化应激是“二次打击学说” 中重要的致病因素[8]。由于过多的脂质堆积在肝细胞中，脂肪酸激活线粒体，微粒体氧化作用，导致活性氧(reactive oxygen species, ROS)的大量生成。一方面脂肪酸影响线粒体正常功能，导致线粒体出现代谢紊乱，细胞色素C漏出，ATP生成下降，影响肝细胞功能系统。另一方面ROS可以引发脂质过氧化，蛋白变性和DNA损伤。大量的脂质过氧化物堆积可以降低肝细胞运输三酰甘油的能力，从而促进肝细胞脂肪变性。

A.change of cytochrome C in the cytosolic and mitochondrial；B.levels of ATP in the liver;*Plt;0.05 compared with control group;#Plt;0.05 compared with MCD group

图3Westernblot检测线粒体及胞质中细胞色素C的水平及小鼠肝组织中ATP含量

Fig3WesternblotanalysisofcytochromecinthecytosolicandmitochondrialandthelevelofATPintheliverofeachgroupmice

文献研究表明Nrf2可以抑制脂质的沉积和氧化应激反应[9]。但是Nrf2能够减轻NASH的机制却并不完善。本实验中，通过姜黄素诱导Nrf2在肝细胞中分泌，从而达到过表达Nrf2的目的。实验结果也表明，Nrf2可以明显改善由于MCD饲料所引发的小鼠体重，肝重和肝指数降低以及由其引发的血清中ALT、AST、GLU含量的降低，保护肝脏功能。与此同时，可以减少脂质在肝细胞中的沉积。由于脂质的沉积减少，作为氧化应激的原料减少，肝细胞中SOD的活性有所降低。氧化应激效应的降低以及脂肪酸含量的减少，使肝脏中线粒体细胞色素C漏出减少，ATP含量稳定，因此其对线粒体损伤具有保护所用。然而关于Nrf2对线粒体损伤保护作用的机制有待更一步深入的研究。

[1] Hayashi A, Suzuki H, Itoh K,etal. Transcription factor Nrf2 is required for the constitutive an inducible expression of mu1tidrug resistance-associated protein 1 in mouse embryo fibroblasts[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2003,310: 824-829.

[2] Charoensuk L, Pinlaor P, Prakobwong S,etal. Curcumin induces a nuclear factor-erythroid 2-related factor 2-driven response against oxidative and nirative stress after praziquantel treatment in liver fluke-infected hamsters[J]. Int J Parasitol, 2011, 41: 615-626.

[3] 邵洛林,许伟华, 周成军, 等. Nrf2在小鼠非酒精性脂肪性肝炎发病机制中的作用[J]. 山东大学学报, 2010, 48:53-56.

[4] 李乒乓, 王龙, 陈维维, 等. 姜黄素对大鼠非酒精性脂肪性肝炎的作用及其机制初探[J].肝脏杂志, 2013,1: 18-22.

[5] Lee GS, Yan JS, Ng RK,etal. Polyunsanturated fat in the methinine-choline-deficient diet influences hepatic inflammation but not hepatocellular injury[J]. J Lipid Res，2007,48: 1885-1896.

[6] 王正, 张静. 姜黄素对小鼠肝损伤的影响[J]. 食品科学杂志, 2007, 10: 501-503.

[7] 刘伟, 马东林. 过表达apoA-I对小鼠分酒精性脂肪性肝炎作用的研究[J]. 中国组织化学与细胞生物学杂志, 2013,2:109-114.

[8] Farrell GC, Larter CZ. Nonalcoholic fatty liver disease: from steatosis to cirrhosis[J]. Hepatology, 2006, 43: 99-112.

[9] Xu W, Shao L, Zhou C,etal. Upregulation of Nrf2 expression in non-alcoholic fatty liver and steatohepatitis[J]. Hepatology, 2011, 58: 2077-2080.

NF-E2-related factor2 alleviates non-alcoholic steatohepatitis in mice

ZHANG Hai-feng1*, WANG Feng1, CAO Jian2

(1.Dept. of Physiology, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010110;2.Dept. of Pathology, Guang’anmen Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 10053, China)

ObjectiveTo investigate the clinical significance of NF-E2-related factor2 in preventing and treating non-alcoholic steatohepatitis(NASH).MethodsC57BL/6 mice were randomly divided into control group (control), model group (MCD) and curcumin induced Nrf2 group (MCD+curcumin). Mice in control group were fed with a standard diet while those in other two groups were fed with methionine choline-deficient (MCD) diet. At the same time, mice in Curcumin induced Nrf2 group were gavaged with 0.9 mL of curcumin daily. Control group and MCD group were gavaged with equal water. 4 weeks later, Nrf2 expression level, liver index, serum ALT and AST levels, serum triglyceride (TG), cholesterol (Chol) and GLU contents were measured, the HE and oil red O staining of liver cross section were observed, hepatic TG, Chol levels, MDA contents, GSH levels and SOD activity were quantified. Cytochrome c and ATP are also measured to investigate the mitochondrial function.ResultsAfter gavaged with Curcumin, compared to MCD group, the mice’s liver showed decreased lipid accumulation, serum ALT,AST, MDA, hepatic TG, Chol, and elevated serum TG and Chol levels.MDA level, Cytochrome c level also decrease, while GSH contents,SOD activity and the content of ATP increase (Plt;0.05).ConclusionsNrf2 has the effect of protection of NASH from MCD diet and primarily through the way of reducing oxidative stress and increasing mitochondrial function.

NF-E2-related factor2, non-alcoholic steatohepatitis, methionine choline-deficient diet, oxidative stress

2013-11-05

2013-12-13

内蒙古医科大学青年创新基金(YKD2013QNCX003)

*通信作者(correspondingauthor)：1980zhanghaifeng@163.com

1001-6325(2014)03-0360-05

研究论文

R333.4

A