高乌甲素在大鼠中脑导水管周围灰质的镇痛机制

肖 智，张福安，张兰英

(遵义医学院 1.医学与生物学研究中心； 2.第一临床学院2009级， 贵州 遵义 563000)

高乌甲素在大鼠中脑导水管周围灰质的镇痛机制

肖 智1*，张福安2，张兰英2

(遵义医学院 1.医学与生物学研究中心； 2.第一临床学院2009级， 贵州 遵义 563000)

目的观察高乌甲素(LA)能否通过上调中脑导水管周围灰质(PAG)中P2X3受体表达和功能，对烧伤疼痛产生镇痛作用。方法建立Ⅱ°烧伤大鼠模型，给予腹腔注射LA 6mg/kg·24h，Von Frey测痛仪检测机械痛阈值(MWT)；Western blot检测P2X3受体蛋白表达；观察干预P2X3受体蛋白的表达和功能后对LA镇痛作用的影响。结果大鼠烧伤后MWT下降(Plt;0.001), 经LA治疗后MWT上升(Plt;0.001)，PAG中P2X3受体蛋白表达上调(Plt;0.001)。下调P2X3受体蛋白表达后减弱LA镇痛作用；P2X3受体激动剂和拮抗剂分别增强和减弱LA的镇痛作用。结论LA通过上调PAG中P2X3受体表达和增强P2X3受体功能，促进机体内源性镇痛，对烧伤疼痛大鼠产生镇痛作用。

高乌甲素；烧伤疼痛；P2X3受体；中脑导水管周围灰质

高乌甲素(lappaconitine，LA)在烧伤疼痛的临床治疗中效果良好，同时LA对炎性疼痛[1]、神经性疼痛[2]以及烧伤疼痛[3]大鼠都有很好的镇痛作用，但对其镇痛机制不清。中脑导水管周围灰质(midbrain periaqueductal gray，PAG) 在内源性镇痛系统中处于核心部位。P2X3受体与疼痛的产生、调制密切相关。烧伤疼痛大鼠经LA治疗后，PAG中P2X3受体表达上调，说明P2X3受体介入了LA对烧伤疼痛的调制过程[3]，本研究将对其机制进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物：雄性清洁级SD大鼠72只，体质量210～220 g，由遵义医学院实验动物中心提供，合格证号：SYXK(黔)2011-003。在温度(24±2)℃、湿度(60±5)%、明暗各12 h(8AM-8PM)周期环境中饲养，每笼5只。大鼠自由饮食及饮水。

1.1.2 试剂：山羊抗大鼠P2X3多克隆受体(Millipore公司)，96.8%氢溴酸高乌甲素(西安飞达生物技术有限公司)，A-317491和α,β-meATP(Sigma公司)，P2X3反义寡聚核苷酸(上海生工生物工程有限公司)，BCA蛋白测定试剂盒(Thermo公司)，化学发光底物检测试剂盒(BioRad公司)。

1.2 方法

1.2.1 烧伤动物模型建立与分组：72只SD大鼠随机分为正常组、烧伤组、烧伤LA组、烧伤LA+ODN、烧伤LA+A317491组和烧伤LA+ATP组，共6组(n=12)。正常组不做任何处理。烧伤建模前7 d将烧伤LA+ODN组、烧伤LA+A317491组和烧伤LA+ATP组大鼠行PAG颅内插管。将烧伤组、烧伤LA组、烧伤LA+ODN组、烧伤LA+A317491组和烧伤LA+ATP组大鼠乙醚麻醉后大鼠右后足浸入70 ℃水中6 s，观察烧伤创面有无水泡等，确认Ⅱ°烧伤模型建模成功。烧伤组大鼠不做其他处理，烧伤LA组、烧伤LA+ODN组、烧伤LA+A317491组和烧伤LA+ATP组大鼠在烧伤前24 h开始，给予LA(6 mg/kg)腹腔注射，1次/24 h，共5次；烧伤LA+ODN组每日另PAG微量注射0.3 μL(0.3 nmol)P2X3反义寡聚核苷酸 (A-ODN)，共5次；烧伤A317491组和烧伤LA+ATP组：取烧伤后48 h大鼠，PAG微量注射0.3 μL(1.5 nmol) A-317491或0.3 μL(3 nmol) αβ-meATP。本实验严格按照国际疼痛学会应用动物进行疼痛研究的伦理纲要操作。

1.2.2 机械痛阈(mechanical withdrawal threshold，MWT)的检测：采用电子Von Frey测痛仪(2390系列，IITC Life Science公司)。将大鼠置于底带孔的有机玻璃笼中，测试前大鼠适应环境30 min，测痛仪刺激大鼠后肢足底中部2s，出现缩足反应时读数为MWT，重复3次取平均值。检测时间点为烧伤前(0 h)以及烧伤后(12、24、36、48、60和72 h)。

1.2.3 Western blot检测P2X3受体蛋白表达：取烧伤后48 h大鼠，每组随机取6只。大鼠4%水合氯醛(20 mL/kg i.p.)麻醉后，取脑组织称重，研脆后加入裂解液；裂解后上清液冷冻干燥形成蛋白沉淀，BCA法蛋白定量；待测样品(蛋白含量20 μg)加样，电泳，电转至PVDF膜。加入一抗：抗大鼠P2X3抗体(1∶600)和抗大鼠β-actin(1∶2 000)，4 ℃孵育过夜后加入二抗。化学增强发光试剂与PVDF膜共孵育后显影，定影。图像进行目标条带扫描(方正扫描仪F5600)，BIO-RAD的生物图像处理系统 (PDQUEST)进行灰度测定，以β-actin为内参对照，对所测目标蛋白的条带灰度进行标准化，得到各组P2X3蛋白相对吸光度值 (relative absorbance,A)。

1.2.4 PAG微量注射：大鼠给予4%水合氯醛麻醉(10 mL/kg i.p.)，麻醉成功后，将大鼠置于脑立体定位仪(SR-5R型，成茂公司)。参照文献行PAG插管及药物注射[4]。

1.2.5 寡聚核苷酸序列的设计和配制：反义寡聚核苷酸的序列是以P2X3 cDNA碱基序列401～419为靶点设计，序列为：5′-TAATCCGACACGTCCATGA-3′溶于无核苷酸超纯水，终浓度为10 nmol/μL。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 烧伤对大鼠MWT影响

烧伤前，6组大鼠MWT值无差异。烧伤后MWT值持续下降；烧伤组在烧伤后48 h MWT值达到最低值，显著低于烧伤前或同时间点正常组MWT值 (Plt;0.001)，其后有小幅缓慢上升 (图1)。

2.3 高乌甲素对烧伤大鼠MWT影响

烧伤大鼠给予LA治疗后其MWT值均高于同时间点烧伤组。烧伤后48 h，烧伤LA组MWT值显著高于烧伤组MWT值 (Plt;0.001) (图1)。

*Plt;0.001 compared with normal group; #Plt;0.01 compared with burn group；##Plt;0.001 compared with burn group图1 高乌甲素对烧伤大鼠机械痛阈的影响Fig 1 Effect of lappaconitine on mechanical withdrawal threshold of burn pain rats

2.4 PAG中P2X3蛋白表达的情况

烧伤组相对吸光度值高于正常组(Plt;0.01)；烧伤LA组大鼠相对吸光度值显著高于烧伤组(Plt;0.001)；烧伤LA+ODN组相对吸光度值低于正常组(Plt;0.001) (图2，3)。

2.5 A-ODN对LA镇痛作用的影响

烧伤建模前，烧伤LA+ODN组大鼠MWT值与其他实验组无差异。烧伤后各观察时间点其MWT值与烧伤组无差异 (图1)。

图2 大鼠PAG中P2X3受体蛋白水平Fig 2 Level of P2X3 receptor protein in rat PAG

*Plt;0.01 compared with normal group; **Plt;0.001 compared with normal group; #Plt;0.001 compared with burn group图3 PAG中P2X3受体蛋白相对吸光度值Fig 3 Relative absorbance of P2X3 receptor protein in rat PAG

2.6PAG微量注射P2X3受体激动剂和拮抗剂对LA的镇痛作用影响

PAG注射P2X3受体激动剂αβ-meATP后10 min，MWT值比注射前显著提高 (Plt;0.001)；PAG注射P2X3受体特异性拮抗剂A317491后10 min，MWT值比注射前显著下降 (Plt;0.001) (图4)。

*Plt;0.001 compared with burn LA group on 48 hr post burn图4 P2X3受体激动剂、拮抗剂对高乌甲素治疗烧伤大鼠机械痛阈的影响Fig 4 Effects of P2X3 receptor agonist and antagonist on mechanical withdrawal threshold of LA-treated burn pain rats

3 讨论

由于烧伤后损伤神经可出现离子通道功能异常、神经异常放电等，导致神经性疼痛，因此烧伤后早期有效的镇痛是避免神经性疼痛的关键[5]。对烧伤疼痛大鼠早期给予腹腔注射LA，可以显著缓解烧伤疼痛大鼠的疼痛症状，升高其痛阈值，其镇痛作用效果与LA剂量相关[3]。破坏PAG结构后可显著减弱LA的镇痛作用，说明LA的镇痛作用至少有PAG的介入[6]。

ATP受体中与疼痛关系最密切的是P2X3受体。总的看来，外周和脊髓的P2X3受体活化可促进疼痛的形成和维持，例如：炎性疼痛和神经性疼痛时，大鼠背根神经节、脊髓背角神经元和外周神经末梢P2X3受体表达上调[2,7]；Ⅰ°和浅Ⅱ°烧伤也引起P2X3受体在烧伤创面神经终末表达上调，促进疼痛产生和维持[8]。对脊髓上结构P2X3受体在疼痛调制中作用的研究相对较少，脑室或蓝斑P2X受体活化可提高大鼠痛阈；炎性疼痛大鼠侧脑室注射α,β-meATP可激活脑干P2X3受体产生镇痛作用，说明脊髓上结构P2X3受体活化可产生镇痛作用[9]。

本研究发现：正常组大鼠PAG仅少量P2X3受体蛋白表达，烧伤引起P2X3受体在PAG表达增加，给予多次腹腔注射LA后，烧伤大鼠PAG中P2X3受体蛋白的表达显著上调伴机械痛阈提高，疼痛相关的行为学变化缓解。

在神经性疼痛调制中，P2X3受体功能比P2X3受体表达更为重要[10]。本研究中，PAG微量注射P2X3受体特异性阻断剂A317491后，烧伤疼痛大鼠的机械痛阈显著下降，减弱LA镇痛作用；相反，给予P2X3受体激动剂α,β-meATP引起烧伤疼痛大鼠机械痛阈显著提高，加强LA镇痛作用。

反义寡聚核苷酸技术(antisense oligonucleotide，ASO)能使研究的目标基因表达下调，进而明确该基因或蛋白的功能。本实验在烧伤大鼠PAG微量注射P2X3受体A-ODN下调P2X3受体蛋白表达后, LA的镇痛作用明显减弱，其机械痛阈值变化趋势与单纯烧伤大鼠无差异。

本研究证实：大鼠烧伤疼痛激活内源性镇痛系统引起PAG中P2X3受体表达上调及功能的增强，产生镇痛效应。由于LA可促进PAG中P2X3受体的表达和功能，因此可加强机体的内源性镇痛作用。

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Analgesic mechanism of lappaconitine in rat midbrain periaqueductal gray

XIAO Zhi1*, ZHANG Fu-an2, ZHANG Lan-yin2

(1.Research Center for Medicine amp; Biology; 2.the First Clincial Institute Grade 2009, Zunyi Medical College, Zunyi 563000, China)

ObjectiveTo investigate the analgesic effect of lappaconitine (LA) and its supraspinal analgesic mechanism with rat model.MethodsMale Sprague-Dawley rats were divided into 6 groups: normal, burn, burn LA，burn LA plus antisense oligodeoxynucleotide (A-ODN)，burn LA plus A317491 and burn LA plus ATP. The later 4 groups had LA (6mg/kg) administered intraperitoneally. The pain threshold was characterized by the mechanical withdrawal threshold (MWT) testing; The expression of P2X3 receptor protein in the midbrain periaqueductal gray (PAG) was assessed by Western blot analysis. Observation the intra-PAG injection of P2X3 A-ODN, selective antagonist and agonist of P2X3 receptor on the analgesic effect of LA were performed.ResultsIn burn group, the MWT was decreased while increased in burn LA group. LA induced a significantly up-regulated P2X3 receptor protein expression in PAG. The antinociceptive effect of LA was attenuated significantly by P2X3 A-ODN. The α,β-meATP or A317491 significantly enhanced or attenuated analgesic effect of LA, respectively.ConclusionsLA produces an antinociceptive effect on burn pain via increases expression and function of P2X3 receptors in the PAG.

lappaconitine; burn pain; P2X3 receptor; midbrain periaqueductal gray

2013-06-25

2013-09-24

贵州省优秀科技教育人才省长专项资金[黔省专合字(2011)59]；遵义医学院大学生创新性实验计划[院发(2012)2906]

*通信作者(correspondingauthor)： 1643255058@qq.com

1001-6325(2014)03-0324-04

研究论文

R 441.1

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