乳腺癌中miR-146a对肿瘤相关巨噬细胞功能的影响

王佳华，马思思，葛晔华，刘彦信，郑德先，史 娟

(中国医学科学院 基础医学研究所 医学分子生物学国家重点实验室， 北京 100005)

乳腺癌中miR-146a对肿瘤相关巨噬细胞功能的影响

王佳华，马思思，葛晔华，刘彦信，郑德先*，史 娟*

(中国医学科学院 基础医学研究所 医学分子生物学国家重点实验室， 北京 100005)

目的探讨miR-146a对肿瘤相关巨噬细胞(TAM)功能的影响及其在TAM中表达水平变化的调控机制。方法分别对比BALB/c小鼠4T1移植瘤TAM和腹腔巨噬细胞(PEC)、人乳腺癌组织TAM和外周血单核细胞，q-PCR法检测miR-146a的表达变化。转染miR-146a antagomir的巨噬细胞与4T1混合接种，确定TAM中miR-146a表达对肿瘤发生发展的影响。结果miR-146a在荷瘤小鼠(Plt;0.05)和人乳腺癌(Plt;0.01)相关巨噬细胞中显著下调。miR-146a inhibitor 明显抑制肿瘤的生长。结论TAM中miR-146a可能通过其对巨噬细胞的调控进而促进肿瘤生长。

microRNA；肿瘤相关巨噬细胞；miR-146a

肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated macrophage，TAM)在肿瘤微环境中的天然免疫细胞的占绝大多数，尤其在某些类型的乳腺癌组织中，巨噬细胞超过总细胞数目的50%。近几年来越来越多的研究表明TAM并未发挥抗肿瘤作用，相反，TAM参与促进肿瘤的发生、生长、 侵袭和转移[1]。临床数据也证明，TAM的数量与肿瘤患者的不良预后呈现高度的相关性[2]。MicroRNA在免疫调节起到关键作用[3]。miR-146a在巨噬细胞中能够靶向IRAK1、IRAK12和TRAF6[4]，参与负反馈调节LPS诱导炎性反应[5]。本研究旨在探讨TAM这种特殊的巨噬细胞中，miR-146a的表达水平变化以及功能。

1 材料与方法

1.1 材料

实时定量检测试剂盒(北京全式金公司)，所用内切酶(TAKARA公司)，荧光定量PCR检测引物(华大基因公司)，质粒大量提取试剂盒(Tiangen公司)，人外周血淋巴细胞分离液(天津市灏洋生物公司)。

1.2 人类正常外周血巨噬细胞和乳腺癌组织标本

正常人外周血标本采集于年龄在20至40周岁的健康志愿者，乳腺癌标本通过乳腺癌病程2期及3期患者的肿瘤切除手术采集得到， 人体标本均知情同意。

1.3 小鼠乳腺癌实体瘤模型

给小鼠背部皮下注射4T1细胞4×105个/只，建立实体瘤模型；于注射3周后取肿瘤分离TAM。

1.4 分离肿瘤相关巨噬细胞

将肿瘤剪成1 mm×1 mm×1 mm以下碎块；置于RPMI-1640消化液(含2%胎牛血清，0.05%胶原蛋白酶Ⅳ，0.005% DNA酶I)中，37 ℃缓慢振荡孵育1 h；细胞悬液过100目筛网，50×g离心3 min，去除残留组织块；取上清400×g离心10 min，沉淀重悬于6 mL RPMI-1640培养基中，转移至60 mm×15 mm细胞培养皿内；5% CO2，37 ℃培养1 h后去掉上清，PBS洗两遍去除未贴壁细胞；所得贴壁的细胞即为TAM。

1.5 分离小鼠腹腔巨噬细胞

给小鼠腹腔注射3%硫代硫酸钠(sodium thiosulfate，TG)培养基，72 h后颈椎脱臼处死；剪开腹部表皮(保留完整腹膜)，注射5mL含枸橼酸钠的PBS；轻轻拍打小鼠腹部，用注射器抽出混有巨噬细胞的PBS溶液；500×g离心10 min；取适量RPMI-1640培养基重悬细胞，置于细胞培养皿内，5% CO2，37 ℃培养1 h后去掉上清，PBS洗两遍去掉未贴壁细胞，所得贴壁细胞即为腹腔巨噬细胞(peritoneal macrophage，PEC)。

1.6 分离人外周血单核细胞

取正常人志愿者外周血20 mL，用3倍体积抗凝剂稀释混匀；按分离液∶稀释全血为1∶2的比例，小心将稀释全血加入分离液上层，4 000r/min离心30 min；吸出白膜层细胞，用PBS洗两次，4 000r/min离心10 min；去掉上清，用1640培养基(10%胎牛血清，青霉素、链霉素)重悬细胞铺于培养皿中，5% CO2，37 ℃培养2 h后去掉未贴壁细胞，所得贴壁细胞即为人外周血单核细胞。

1.7 q-PCR法检测miR-146a的表达量

对10位女性乳腺癌患者TAM和健康人外周血单核细胞PBMC进行分离培养，将所获得的TAM和外周血单核细胞转移至6孔板中经短暂培养后提取RNA，以miR-146a特异性茎环引物进行反转录(表1)，并对TAM和腹腔巨噬细胞miR-146a以ΔΔCt法进行qPCR定量分析，以人U6做为内参。

1.8小鼠体内移植瘤模型建立及miR-146a表达变化对肿瘤生长的影响

分别以miR-146a antagomir和阴性对照转染腹腔巨噬细胞，并以1∶3的比例与4T1细胞混合接种于5只BALB/c小鼠背部皮下。从接种后的第6日开始，每3日用游标卡尺测量一次肿瘤的体积(以1/2×长×宽×宽表示)，并于24日后断颈处死荷瘤小鼠，剥离肿瘤后称重。

表1 所用定量PCR引物Table 1 List of primer sequences used for q-PCR

2 结果

2.1 4T1肿瘤TAM中miR-146a显著下调

小鼠4T1移植瘤获得的TAM和PEC腹腔巨噬细胞中miR-146a定量分析(表1)结果显示，miR-146a在TAM中含量明显低于腹腔巨噬细胞(图1)。

Each RNA sample was set three repeat wells, and mouse U6 as a reference;*Plt;0.05 compared with control group图1 PEC和TAM miR-146a表达差异Fig 1 The difference of miR-146a expression

2.2乳腺癌患者TAM中miR-146a显著低于健康人外周血单核细胞(Peripheralbloodmononuclearcell,PBMC)

在对10位女性乳腺癌患者TAM和健康人外周血单核细胞PBMC的分析中，结果显示miR-146a在乳腺癌患者TAM中含量明显低于PBMC(图2)。

*Plt;0.01 compared with PBMC control group图2 人类外周血单核细胞PBMC与乳腺癌患者TAM中miR-146a表达差异Fig 2 miR-146a expression in PBM and TAM in patients with breast cancer, U6 as a reference

2.3miR-146a表达受抑制的巨噬细胞能显著抑制小鼠乳腺癌移植瘤生长

转染miR-146a antagomir的巨噬细胞能够显著抑制4T1肿瘤生长，肿瘤体积明显小于对照组，肿瘤重量也显著低于对照组(图3)。

*Plt;0.05 compared with NC group;**Plt;0.01 compared with NC group图3 转染miR-146a antagomir的巨噬细胞抑制4T1移植瘤生长Fig 3 miR-146a antagomiR-transfected PEC inhibited the growth of 4T1 xenograft tumor(±s,n=5)

3 讨论

局部浸润和远处转移是恶性肿瘤最重要的特点，也是恶性肿瘤致死的主要原因。肿瘤相关巨噬细胞对肿瘤的发展有着极其重要的影响，几乎覆盖了肿瘤从形成到转移的各个环节。TAM通过分泌免疫抑制性因子负调控机体的抗肿瘤免疫，从而直接或间接促进肿瘤生长；TAM表达大量VEGF、IL-1等促进血管发生的递质，参与肿瘤微血管发生；在淋巴管发生中，淋巴管密度与TAM密度正相关；TAM还可分泌MMP-9和MMP-2等参与对肿瘤外基质的降解等等。

miR-146a在巨噬细胞中能够靶向IRAK1、IRAK2和TRAF6[4]，参与负反馈调节LPS诱导炎性反应，巨噬细胞M2极化过程中miR-146a表达水平上升[6]。相反地，本实验发现miR-146a在TAM表达下调。这提示在TAM中miR-146a可能存在更为复杂的表达调控机制，同时也在小RNA水平上提示TAM和普通M2型巨噬细胞之间的区别。

本实验对人和鼠乳腺癌TAM中miR-146a的表达水平和功能进行研究，可能为寻找抑制肿瘤的途径提供思路。

[1] Cho HJ, Jung JI, Park JH,etal. Bone marrow-derived, alternatively activated macrophages enhance solid tumor growth and lung metastasis of mammary carcinoma cells in a Balb/C mouse orthotopicmodel[J]. Breast Cancer Res, 2012,14:R81.

[2] Chen JJ, Lin YC, Yang PC,etal. Tumor-associated macrophages: the double-edged sword in cancer progression [J]. Clin Oncol, 2005, 23:953-64.

[3] Gracias DT,Katsikis PD. MicroRNAs: key components of immune regulation [J]. Adv Exp Med Biol, 2011, 780: 15-26.

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The impact of miR-146a on the function of tumor-associated macrophage in breast cancer

WANG Jia-hua, MA Si-si, GE Ye-hua, LIU Yan-xin, ZHENG De-xian*, SHI Juan*

(National Laboratory of Mediacal Biology, Institute of Basic Medical Sciences, CAMS amp; PUMC, Beijing 100005, China)

ObjectiveTo investigate the influence of miR-146a on the function of tumor-associated macrophage (TAM), and the mechanism of its expression regulation.MethodsWe compared TAM in 4T1 xenografted tumor grown in BALB/c mouse to peritoneal macrophage (PEC), and TAM in human breast cancer to PBMC respectively to detect the expression of miR-146a using q-PCR method. Mixed subcutaneously implantation of miR-146a antagomiR-transfected macrophages with 4T1 cells was used to determine the function of miR-146a in TAM.ResultsmiR-146a was significantly down-regulated in breast cancer-associated macrophage in both 4T1 tumor grown in mice (Plt;0.05) and breast cancer patients (Plt;0.01). It was observed that macrophage with decreased miR-146a expression inhibited the 4T1 tumor cell growthinvivo.ConclusionsmiR-146a can regulate the function of tumor associated macrophage, so as to promote tumor growth.

microRNA；tumor associated macrophage；miR-146a

2013-11-08

2013-12-13

国家自然科学基金(81171980，91029735)

*通信作者(correspondingauthor)： shijuantt@163.com; zhengdx@pumc.edu.cn

1001-6325(2014)03-0310-04

研究论文

R 730.51

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