ERK1/2 MAPK通路在Eca109细胞体外增殖和迁移中的作用及其机制

刘凤霞，牛淑亮，李建勇，郑树涛，卢晓梅，刘文亚

(新疆医科大学 1.基础医学院 人体解剖学教研室； 2.第一附属医院 医学研究中心；3.第一附属医院 影像中心， 新疆 乌鲁木齐 830011)

ERK1/2 MAPK通路在Eca109细胞体外增殖和迁移中的作用及其机制

刘凤霞1，牛淑亮1，李建勇1，郑树涛2，卢晓梅2，刘文亚3*

(新疆医科大学 1.基础医学院 人体解剖学教研室； 2.第一附属医院 医学研究中心；3.第一附属医院 影像中心， 新疆 乌鲁木齐 830011)

目的观察ERK1/2 MAPK通路在食管鳞状细胞癌(ESCC)Eca109细胞系增殖和迁移中的作用并探讨其作用机制。方法使用MAPK(ERK1/2)抑制剂U0126处理Eca109细胞；细胞计数检测细胞增殖；倒置显微镜下观察细胞形态；实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测ERK1/2 mRNA；Western blot检测总ERK1/2(t-ERK1/2)和磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)；MTT和细胞划痕实验检测细胞增殖和迁移能力；qRT-PCR检测MicroRNA-21(miR-21)。结果20 μmol/L浓度的U0126可抑制Eca109细胞生长(Plt;0.05)，破坏细胞正常形态，ERK1/2 MAPK通路的活化在蛋白质水平被抑制(Plt;0.05)，Eca109细胞增殖和迁移明显减弱(Plt;0.05)，显著下调miR-21的表达(Plt;0.05)。结论ERK1/2 MAPK信号通路抑制可减弱Eca109细胞增殖和迁移，其可能的作用机制之一与其抑制miR-21表达有关。

ERK1/2；Eca109细胞；增殖；迁移；MicroRNA-21

食管癌是最常见的恶性肿瘤之一，在恶性肿瘤中其发病率位居第9位，死亡率居第6位[1]，其中食管鳞癌占食管癌的90%以上。目前的治疗以手术切除治疗为主，结合放化疗综合进行，虽然这些方法对某些早期发现的恶性肿瘤可起到根治性作用，但多数食管癌患者确诊时已处于晚期阶段，对这些患者仅仅起到姑息性治疗作用，5年生存率仅为10%左右[2]，中位生存时间仅8～13个月[3]，患者最终死于肿瘤的转移和复发。细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular signal regulated protein kinase, ERK)相关的细胞内信号传导途径被认为是经典的丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)信号传导途径。ERK1/2正常定位于胞质内，当激活后进入细胞核，ERK肽链的183位苏氨酸和185位酪氨酸均发生磷酸化为该激酶活化所必须[4]。活化的ERK1/2信号传导途径作用于多种转录因子及核蛋白，促进某些基因的转录与表达，参与肿瘤细胞增殖、分化、迁移、侵袭和凋亡等多种生物学效应，ERK1/2的过度表达在细胞恶性转化及演进中起着重要的作用。因此研究ERK1/2 MAPK通路在食管鳞癌Eca109细胞体外增殖和迁移中的作用及其作用机制，有望为食管鳞癌的早期诊断、早期防预、早期治疗提供线索并且希望为联合治疗注入新的思路。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

食管鳞癌细胞系Eca109 (中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)，胎牛血清(FBS)、DMEM培养基(Gibco公司)，U0126(Promega公司)，用234 μL二甲基亚砜(DMSO)重悬1 mg U0126，即可得到浓度为10 mmol/L的储存液，无抗无血清DMEM培养液稀释U0126储存液成所需浓度工作液，顺铂(齐鲁药业有限公司)，Trizol、WesternBreeze 免疫检测试剂盒(Invitrogen公司)，DMSO、methylthiazolyl blue tetrazolium(MTT)(Sigma公司)，PrimeScriptTMone step RT-PCR kit反转录试剂盒、SYBR Premix(大连宝生物公司)， RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒(博迈德公司)，ERK1/2抗体(Celling Signaling Technology 公司)， β-tubulin抗体(Santa Cruz Biotechnology公司)，RT-PCR引物由TaKaRa公司设计并合成，引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Primer sequence for qRT-PCR

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和U0126干预: Eca109细胞分为4个组，分别是对照组(NC)、DMSO组、U0126组和抗肿瘤药物顺铂组(DDP)。5×105个/孔接种6孔板，含有5%胎牛血清的DMEM培养液，37 ℃、5% CO2的培养箱内孵育，正常培养24 h达到80%汇合，用磷酸缓冲液(PBS)洗去悬浮细胞，20 μmol/L浓度的MAPK(ERK1/2)抑制剂U0126干预Eca109细胞。

1.2.2 细胞计数：在显微镜下用10×物镜观察计数四角大分格中的细胞数， 细胞数/mL=(4大格细胞数之和/4)×104×稀释倍数，每组设6个复孔。

1.2.3 倒置显微镜下观察细胞形态:倒置显微镜下放大200倍观察各组细胞0、24、48和72 h细胞形态学变化并采集图像，每组设6个复孔。

1.2.4 qRT-PCR扩增:Trizol方法抽提细胞中的总RNA，反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA。qRT-PCR反应体系为20 μL，模板2 μL(2 μg)，β-actin、ERK1/2的上、下游引物(表1)各0.5 μL(10 pmol)，SYBR 10 μL、 ddH2O 7 μL，扩增条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性5 s，57.8 ℃退火30 s，40个循环。分别以miR-21和U6反转录引物行反转录反应，miR-21和U6的特异性引物(表1)进行qRT-PCR，反应参数为95 ℃预变性10 min；95℃变性15 s，60 ℃退火30 s，40个循环，每组设6个复孔。

1.2.5 Western blot：1×106个细胞加入RIPA裂解液80 μL，12 000r/min离心5 min，收集上清，BCA法测定蛋白质浓度。取50 μg蛋白质于10%十二烷基磺酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶中，25 mA/胶恒定电流电泳至分离胶底端；80 V恒定电压、常温、100 min转至PVDF膜上，封闭1 h。加入β-tubulin、t-ERK1/2、p-ERK抗体(1∶1 000稀释于一抗稀释液中)于4 ℃过夜。加入通用性二抗，室温反应2 h，显色试剂作用直至条带出现，ddH2O终止显色反应。信号条带利用Quantity one软件进行灰度扫描，每组实验重复6次。

1.2.6 MTT检测细胞增殖：5×104个/孔接种于96孔培养板中，标准条件下培养过夜，更换培养液。分别于U0126处理后0、24、48、72和96 h加入5 g/L MTT，20 μL/孔, 37 ℃培养4 h。去上清加入150 μL DMSO, 37 ℃避光摇动10 min，ELISA读板机(490 nm)测定吸光度，每组均设置6个复孔。

1.2.7 细胞划痕实验：用无菌枪头对孔内细胞做划痕，PBS冲洗细胞，正常培养。0、24、48和72 h通过倒置显微镜观察细胞划痕并采集图像，用刻度尺测量划痕宽度，评估伤口愈合程度。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 不同浓度U0126对Eca109细胞增殖的影响

U0126对Eca109细胞增殖的抑制具有浓度依赖性，20 μmol/L浓度的U0126可明显抑制细胞增殖，并且抑制效果温和(Plt;0.05)(图1)，能够达到研究的要求，故后续研究都采用20 μmol/L浓度的U0126干预细胞。

*Plt;0.05 compared with NC group图1 不同浓度U0126对Eca109细胞增殖的影响Fig 1 The effect of different concentration of U0126 on the proliferation of Eca109 cell line

2.2 U0126对Eca109细胞形态的影响

20 μmol/L浓度的U0126显著改变Eca109细胞的形态结构。与NC和DMSO组相比，U0126组细胞变得比较小，呈梭状或叠瓦样，多边形，轮廓不清，胞膜多棱角，核及核仁不清，胞质内粗糙，可见多量粉尘样细胞器堆积物，细胞易老化，汇合后排列不够紧密，铺路石样外观不典型，相互接壤处模糊，上皮膜边缘不整齐(图2)。

A.NC group；B.DMSO group；C.U0126 group；D.DDP group图2 U0126干预后Eca109细胞形态Fig 2 Cell morphology in Eca109 cell line after dealed with U0126(×200)

2.3U0126对Eca109细胞中ERK1/2MAPK通路的影响

Eca109细胞经浓度为20 μmol/L的U0126处理48和72 h后，与NC组和DMSO组相比，U0126组和DDP组中ERK1/2 mRNA表达无明显变化(图3)，U0126组和DDP组中t-ERK1/2蛋白表达无变化，而U0126组中p-ERK1/2表达明显抑制 (Plt;0.05)(图4)。

图3 U0126对ERK1/2 mRNA表达的影响Fig 3 The effect of U0126 on ERK1/2 mRNA

*Plt;0.05 compared with NC and DMSO group图4 U0126干预后Eca109细胞中ERK1/2蛋白表达Fig 4 The effect of U0126 on ERK1/2 protein expression in Eca109 cell line

2.4ERK1/2MAPK通路对Eca109细胞增殖的影响

食管癌Eca109细胞经浓度为20 μmol/L的U0126处理0、24、48、72和96 h后，与NC和DMSO组相比，U0126和DDP组中细胞增殖明显被抑制(Plt;0.05)，与抗肿瘤药物DDP组相比，U0126组细胞增殖变化差异不显著(图5)。

*Plt;0.05 compared with NC and DMSO group图5 U0126干预后Eca109细胞增殖Fig 5 The porliferation of Eca109 cell after dealed with U0126

2.5ERK1/2MAPK通路对Eca109细胞迁移的影响

食管癌Eca109细胞经浓度为20 μmol/L的U0126处理0、24、48 和72 h后, 与NC和DMSO组相比，U0126和DDP组中细胞迁移明显被抑制(Plt;0.05)，与抗肿瘤药物DDP组相比，U0126组细胞增殖变化差异不显著(图6)。

*Plt;0.05 compared with NC and DMSO group图6 细胞划痕实验检测U0126干预后Eca109细胞迁移Fig 6 Wound scratch assay detected the migration of Eca109 cell after dealed with U0126

2.6ERK1/2MAPK通路对Eca109细胞中miR-21表达的影响

食管癌Eca109细胞经浓度为20 μmol/L的U0126处理48 h后, 与NC组和DMSO组相比，U0126组中miR-21表达明显下调(Plt;0.05)(图7)。

3 讨论

ERK1/2 MAPK通路阻断可抑制胃癌、乳腺癌等细胞凋亡、促进细胞侵袭，并且抑制miR-21及其靶基因表达[5-7]。MiR-21是microRNA家族中的一个亚型，在大多数恶性肿瘤中，如胃癌[8]、结直肠癌[9]、胰腺癌[10]等细胞或组织中，miR-21的表达均显著升高。本研究发现20 μmol/L浓度的U0126在蛋白质水平明显阻断Eca109细胞中ERK1/2 MAPK通路活化，并且使其失去正常细胞形态结构。ERK1/2 MAPK通路活化被阻断后，Eca109细胞增殖和迁移明显被抑制，细胞中miR-21表达显著下调，这些结果表明ERK1/2 MAPK通路阻断可抑制Eca109细胞增殖和迁移，其可能的机制之一是ERK1/2 MAPK信号通路正调控具有癌基因作用的miR-21表达。本研究进一步揭示ERK1/2在食管鳞癌中发挥癌基因的作用，为解决食管鳞癌癌增殖和迁移问题提供一定的理论依据，也将会为临床上食管鳞癌的治疗及预后判断提供新的思路和方法。

*Plt;0.05 compared with NC and DMSO group图7 U0126干预后Eca109细胞中miR-21表达下调Fig 7 U0126 downregulated the miR-21 expresson in Eca109 cell line(±s,n=6)

[1] Parkin DM, Bray F, Ferlay J,etal. Estimating the world cancer burden:Globocan 2000 [J]. Int J Cancer, 2001, 94:153-156.

[2] Ekman S, Dreilich M, Lennartsson J,etal. Esopha-geal cancer: current and emerging therapy modalities [J]. Expert Rev Anticancer Ther, 2008,8:1433-48.

[3] González Ortiz DI, Toro DH. Esophageal cancer subtypes and survival rates at the VA Caribbean Healthcare System: a 10-year experience[J]. Bol Asoc Med P R, 2009,101:14-17.

[4] Whitmarsh AJ,Davis RJ.Transcription factor AP-1 regulation bymitogen-activated protien kinase signal transduction pathway[J]. Mol Med,1996,74: 589-607.

[5] Lim SC, Duong HQ, Parajuli KR,etal. Pro-apoptotic role of the MEK/ERK pathway in ursode-oxycholic acid-induced apoptosis in SNU601 gastric cancer cells[J]. Oncol Rep, 2012, 28: 1429-34.

[6] Ling M, Li Y, Xu Y,etal. Regulation of miRNA-21 by reactive oxygen species-activated ERK/NF-κB in arsenite-induced cell transformation[J]. Free Radic Biol Med, 2012, 52: 1508-1518.

[7] Huang TH, Wu F, Loeb GB,etal. Up-regulation of miR-21 by HER2/neu signaling promotes cell invasion[J]. J Biol Chem, 2009,284: 18515-18524.

[8] Yamanaka S, Olaru AV, An F,etal. MicroRNA-21 inhibits Serpini1, a gene with novel tumour suppressive effects in gastric cancer[J]. Dig Liver Dis, 2012，44:589-596.

[9] Faltejskova P, Besse A, Sevcikova S,etal. Clinical correlations of miR-21 expression in colorectal cancer patients and effects of its inhibition on DLD1 colon cancer cells[J]. Int J Colorectal Dis, 2012, 27: 1401-1408.

[10] Moriyama T, Ohuchida K, Mizumoto K,etal. MicroRNA-21 modulates biological functions of pancreatic cancer cells including their proliferation, invasion, and chemoresistance[J]. Mol Cancer Ther, 2009, 8:1067-1074.

The role and mechanism of ERK1/2 MPAK
pathway in proliferation and migration of Eca109 cell lineinvitro

LIU Feng-xia1, NIU Shu-liang1, LI Jian-yong1, ZHENG Shu-tao2, LU Xiao-mei2, LIU Wen-ya3*

(1.Dept. of Anatomy, College of Basic Medicine；2.Medical Research Center, the First Affiliated Hospital；3.Dept. of Radiology，the First Affiliated Hospital，Xinjiang Medical University, Urumqi 830011，China)

ObjectiveTo investigate the role and mechanism of ERK1/2 MPAK pathway in regulating proliferation and migration of Eca109 cell lineinvitro.MethodsWe treated Eca109 cells with MAPK(ERK1/2)inhibitor(U0126); cell counting method detected the cell proliferation; Cell morphology was observed under inverted microscope；qRT-PCR detectedERK1/2 mRNA level; Western blot determined the expression of ERK1/2 protein level; MTT and Wound scratch assay detected cell proliferation and migration; qRT-PCR examined miR-21 expression.ResultsCell growth was inhibited by U0126 at 20 μmol/L doses(Plt;0.05), destroyed the normal cell morphology; inactivited ERK1/2 MPAK pathway at protein level(Plt;0.05); inhibition of ERK1/2 MPAK pathway repressed cell proliferation and migration of Eca109 cells and downregulated the expression ofmiR-21(Plt;0.05).ConclusionsInhibition of ERK1/2 MPAK pathway inhibits proliferation and migration of Eca109 cells, one of the most possible mechanism is associated it’s effect onmiR-21 expression.

ERK1/2; Eca109 cell; proliferation; migration; MicroRNA-21

2013-06-15

2013-10-09

新疆自治区科技厅面上项目(2012211A080)

*通信作者(correspondingauthor)： wenyaliu2002@163.com.cn

1001-6325(2014)03-0345-05

研究论文

R 735.1

A