P38抑制剂SB203580对大鼠脑缺血再灌注后AQP4 表达及脑水肿的影响

王耀辉，李国辉，袁 微

(1.桂林医学院 研究生学院，广西 桂林 541004； 2.桂林医学院 附属梧州市红十字会医院 神经内科， 广西 梧州 543002)

P38抑制剂SB203580对大鼠脑缺血再灌注后AQP4 表达及脑水肿的影响

王耀辉1，李国辉2*，袁 微1

(1.桂林医学院 研究生学院，广西 桂林 541004； 2.桂林医学院 附属梧州市红十字会医院 神经内科， 广西 梧州 543002)

目的探讨P38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)抑制剂SB203580对大鼠脑缺血再灌注后脑组织水通道蛋白4(AQP4) 表达及脑水肿的影响。方法SPF 级雄性SD 大鼠54只，随机分为假手术组(sham组)、模型组(I/R组)和P38抑制剂组(SB203580组)。用线栓法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型。模型组与P38抑制剂组分别于造模前15 min舌下静脉注射10%二甲基亚砜(DMSO,400 μg/kg)和P38抑制剂(SB203580,400 μg/kg)。缺血2 h再灌注24 h后对大鼠进行神经功能缺损评分，采用HE染色观察大鼠脑组织病理改变，干湿比重法测定缺血半球的脑含水量，Western blot 检测磷酸化P38(p-P38) 和AQP4 蛋白的表达、RT-PCR法检测AQP4 mRNA的表达。结果与I/ R组相比，SB203580组大鼠神经功能缺损症状明显改善，缺血侧半球脑含水量明显降低(Plt;0.05)。I/ R组大鼠缺血周边区脑组织p-P38、AQP4蛋白 及mRNA 的表达分别为2.463±0.138、2.660±0.130及1.065±0.125，高于SB203580组的1.653±0.105、1.771±0.092及0.552±0.069 (Plt;0.05)。结论P38抑制剂SB203580减轻大鼠脑缺血再灌注后AQP4表达及脑水肿，其机制可能与SB203580抑制P38信号通路的激活降低了下游AQP4的表达有关。

脑缺血再灌注；脑水肿；水通道蛋白4；P38；SB203580

P38是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)家族的一员，在细胞水肿中起着重要作用。研究表明，抑制P38的激活可降低星形胶质细胞AQP4(aquaporin 4)表达及细胞水肿[1]。本研究应用4-(4-氟苯)-2-(4-(甲磺酰苯)-5-(4-吡啶基)-1氢-咪唑(SB203580)抑制脑缺血再灌注大鼠P38通路的激活，观察SB203580对大鼠脑缺血再灌注后水通道蛋白4(aquaporin 4,AQP4)表达及脑水肿的影响，探讨其作用的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂

SPF级雄性SD大鼠(体质量240～260 g)，由广西医科大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK (桂) 2009-0002。4-(4-氟苯)-2-(4-(甲磺酰苯)-5-(4-吡啶基)-1氢-咪唑(SB203580)(Selleck公司)，二甲基亚砜(DMSO)(Sigma公司)，抗总P38抗体、抗p-P38抗体和抗AQP4抗体(Santa Cruz公司)，抗β-actin抗体、羊抗兔IgG抗体(碧云天公司)，RT-PCR反转录试剂盒(TAKARA公司)。

1.2 局灶性脑缺血再灌注模型制备

大鼠54 只，随机分成3组(n=18只)：假手术组、模型组和P38抑制剂组。模型组和P38抑制剂组分别在制备局灶性脑缺血再灌注模型前15 min通过舌下静脉注射10%二甲基亚砜(DMSO，400 μg/kg)和P38抑制剂(SB203580，400 μg/kg)。用改良的Zea-Longa 线栓法[2]制备局灶性脑缺血再灌注模型。假手术组：手术操作同模型组，但线栓插入深度lt;9 mm，不做脑梗死。

1.3 大鼠神经功能缺损评分

大鼠经缺血2 h再灌注24 h后，参照Zea-Longa 法[2]对其进行神经功能缺损评分：0 分，无神经功能缺损症状；1 分，对侧前爪不能完全伸展；2 分，向对侧转圈；3分，向对侧倾倒；4 分，不能自发行走。造模成功的标志：神经功能缺损评分1～3分，且断头取脑后大脑中动脉无出血或血管内血栓形成。

1.4 组织切片制备及HE染色

缺血2 h再灌注24 h，麻醉大鼠，先后4 ℃ 0.9%氯化钠注射液100 mL、4%多聚甲醛150 mL心脏灌洗，取脑，固定、石蜡包埋，HE染色。

1.5 脑组织含水量测定

缺血2 h再灌注24 h，麻醉后迅速取脑，用锡箔纸包裹。称湿重后，将脑组织置于100 ℃恒温干燥箱中，烘干24 ～48 h至恒重，是为干重。计算脑含水量：脑含水量(BWC)=(湿重-干重)/湿重×100%。

1.6Westernblot检测脑组织p-P38、P38和AQP4的表达

缺血2 h再灌注24 h，麻醉后，于冰上切取缺血周边区皮层脑组织。提取总蛋白，制备SDS-PAGE凝胶，加样电泳。湿转法将蛋白条带转移至PVDF膜上，置入封闭液中(5%脱脂奶粉)常温封闭1 h，封闭后加一抗P38(1∶1 000)、p-P38(1∶1 000)、AQP4(1∶300)及β-actin(1∶500)抗体，4 ℃孵育过夜，加入HRP标记的二抗(羊抗兔IgG，1∶1 000)，37 ℃孵育1 h，ECL曝光、显影及定影。以β-actin作为内参。光片扫描后用Quantity One系统分析吸光度， p-P38/P38的比值记为p-P38的表达水平，AQP4/β-actin的比值记为AQP4的表达水平。

1.7 RT-PCR 检测AQP4 mRNA 的表达

按照Trizol试剂说明提取总RNA，按反转录试剂盒进行反转录。产物进行PCR扩增。以β-actin为内参。AQP4[3]上游引物：5′-TTGGACCAATCATA GGCGC-3′，下游引物：5′-GGTCAATGTCGATCACAT GC-3′(扩增片段长度255 bp)。β-actin上游引物：5′-TTCGCGGGCGACGATGC-3′，下游引物为：5′-CGA AGTCCAGGGCGAC-3′(扩增片段长度为609 bp)。扩增条件：94 ℃变性5 min，94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃延伸10 min。AQP4及β-actin各30个循环。RT-PCR 产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，长波紫外灯下观察拍照。Quantity One 系统分析吸光度，AQP4/β-actin 的比值记为AQP4 mRNA表达水平。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 神经功能评分的结果

假手术组大鼠神经功能正常。模型组大鼠神经功能缺损明显(Plt;0.05)；P38抑制剂组有改善(Plt;0.05)(表1)。

2.2 脑组织病理改变的结果

假手术组大鼠脑组织结构正常， 胞质及胞核清晰。模型组神经细胞体积缩小，胞质疏松，核固缩，凋亡小体形成。与模型组相比，P38抑制剂组神经细胞坏死程度较轻(图1)。

2.3 脑组织含水量的结果

假手术组大鼠脑组织有一定的含水量。与假手

术组相比，模型组和P38抑制剂组大鼠脑组织含水量增加 (Plt;0.05)；与模型组相比，P38抑制剂组大鼠脑组织含水量减少 (Plt;0.05)(表1)。

表1 SB203580对各组大鼠神经功能评分及脑含水量的影响Table 1 The effect of SB203580 on cerebral edema and neurological function in each group

*Plt;0.05 compared with sham group;#Plt;0.05 compared with I/R group.

2.4脑组织p-P38与AQP4蛋白及AQP4mRNA表达的结果

与假手术组相比，模型组大鼠缺血周边区脑组织p-P38的表达增加(Plt;0.01)，AQP4和AQP4 mRNA的表达上调(Plt;0.01)；与模型组相比，P38抑制剂组大鼠缺血周边区脑组织p-P38的表达减少(Plt;0.01)，AQP4和AQP4 mRNA的表达下调(Plt;0.01)(表2;图2,3,4)。

A.sham group； B.I/R group； C.SB203580 group图1 SB203580对缺血脑组织病理学改变的影响Fig 1 The effect of SB203580 on ischemic brain tissue pathology(×200)

表2 SB203580对缺血脑组织内AQP4蛋白和mRNA表达及P38MAPK磷酸化水平的影响Table 2 The effect of SB203580 on AQP4, AQP4 mRNA and p-P38 expression in ischemic brain tissue(±s,n=6)

*Plt;0.05 compared with sham group;#Plt;0.05 compared with I/R group.

图2 SB203580对脑缺血周围组织内p-P38水平的影响Fig 2 The effect of SB203580 on the level of p-P38 in the surrounding tissues of cerebral ischemia

图3 SB203580对脑缺血周围组织内AQP4表达的影响Fig 3 The effect of SB203580 on AQP4 expression in the surrounding tissues of cerebral ischemia

图4 SB203580对脑缺血周围组织内AQP4 mRNA表达的影响Fig 4 The effect of SB203580 on AQP4 mRNA expression in the surrounding tissues of cerebral ischemia

3 讨论

P38 MAPK广泛分布于生物体内，可被炎性反应、氧化应激和缺血缺氧等激活，在神经系统疾病的信号传导中发挥重要作用[4]。AQP4是中枢神经系统的主要水通道蛋白，在脑组织水平衡的调节中起到关键作用[5]。研究表明，AQP4的高表达与细胞毒性脑水肿程度呈正相关[6]，调节星形胶质细胞AQP4的表达可减轻脑水肿的程度[7]。本研究发现，与假手术组相比，模型组大鼠缺血周边区脑组织p-P38、AQP4及AQP4 mRNA的表达增高且伴脑水含量的增加，提示脑缺血再灌注损伤后P38信号通路被激活，致使AQP4高表达，进而增加脑含水量。

P38的激活对缺血性脑卒中后脑水肿起着重要作用，抑制P38的激活可有效减轻脑水肿[8]。SB203580是P38的特异性抑制剂，通过股静脉注射SB203580可以抑制P38的激活[9]。舌下静脉较股静脉表浅，不会由于操作损伤大鼠的肢体运动功能，可避免操作对神经功能缺损评分的影响。因此，本研究采用舌下静脉注射SB203580的方式抑制P38的激活。以往研究发现，阻断P38的激活可以降低星形胶质细胞氧糖剥夺/复氧模型中AQP4及AQP4 mRNA的表达[10]，减轻大鼠脑创伤后脑水肿的程度[9]。本研究发现，与模型组相比，P38抑制剂组大鼠缺血周边区脑组织p-P38、AQP4及AQP4 mRNA的表达降低且伴脑含水量减少，提示P38抑制剂SB203580抑制P38的激活，导致AQP4的表达下调，减少脑含水量。

综上所述， SB203580可以降低大鼠脑缺血再灌注后AQP4的表达及脑水肿的形成，其作用机制可能与抑制P38激活、降低下游AQP4的表达有关。然而，SB203580对脑缺血再灌注后AQP4表达及脑水肿形成的具体作用机制仍有待于进一步研究。

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P38 MAPK inhibitor SB203580 decreases the AQP4 expression and cerebral edema of rats after cerebral ischemia and reperfusion

WANG Yao-hui1, LI Guo-hui2*, YUAN Wei1

(1.Graduate School of Guilin Medical College, Guilin 541004; 2.Dept. of Neurology, Wuzhou Red Cross Hospital, Wuzhou 543002, China)

ObjectiveTo explore the role of P38 inhibitor SB203580 on cerebral edema and Aquaporin 4(AQP4) expression after cerebral ischemia reperfusion in rats.MethodsFifty-four SPF male Sprague-Dawley rats weighing 240-260 g were randomly divided into 3 groups: sham operation group(sham grope); ischemia reperfusion group(I/R group); P38 inhibitor group(SB203580 group).The focal ischemia reperfusion rat model was established by the modified suture method. The rats of I/R group and SB203580 group were exposed to DMSO(10%,400 μg/kg) or P38 inhibitor SB203580(400 μg/kg) 15 min before suffered from cerebral ischemia. Neurologic function was scored at 24 h reperfusion after 2 h ischemia. HE staining was used to examine brain tissue injury, wet-dry ratio was measured to estimate cerebral edema, Western blot was used to detect the expression of p-P38 and AQP4, RT-PCR was used to detect AQP4 mRNA.ResultsP38 inhibitor SB203580 improved behavioral scores of ischemic reperfusion rats. The brain water content was decreased after SB203580 treatment compared with I/R group(0.792±0.010vs0.817±0.012). The expression of p-P38, AQP4 and AQP4 mRNA in margin of infarction of SB203580 group are decreased as compared with I/R group compared with I/R group.ConclusionsP38 inhibitor SB203580 alleviates AQP4 expression and cerebral edema in cerebral ischemia reperfusion rats through P38 MAPK pathway.

cerebral ischemia reperfusion; cerebral edema; aquaporin 4; P38;SB203580

2013-07-01

2013-09-24

*通信作者(correspondingauthor)： wzhhgh@163.com

1001-6325(2014)03-0381-05

研究论文

R 743

A