程序性坏死机制与缺血再灌注损伤

叶周恒，刘文武，孙学军

(第二军医大学 潜水医学教研室， 上海 200433)

程序性坏死机制与缺血再灌注损伤

叶周恒，刘文武，孙学军*

(第二军医大学 潜水医学教研室， 上海 200433)

程序性坏死是一种具有可调控的信号传导通路的细胞坏死方式。多种刺激可导致程序性坏死的发生，复合体Ⅰ、复合体Ⅱ和RIP1-RIP3坏死体是通路中的信号分子，而Necstatin-1是程序性坏死的特异性阻断剂。程序性坏死可能是缺血再灌注损伤中细胞死亡的重要方式。

程序性坏死；受体相互作用蛋白激酶1；受体相互作用蛋白激酶3

坏死是一种重要的细胞死亡方式，生理和病理条件下均可发生，主要表现为细胞器水肿、活性氧和胞内钙升高、ATP含量下降以及细胞器和细胞膜最终破裂。过去认为坏死是不可调控的，因此，相对于凋亡而言，坏死的研究较少。然而，最近发现某些特殊的细胞中，给予特定的诱导剂，同时抑制凋亡通路后，可发生具有一定分子基础的、可调控的细胞坏死，这种细胞死亡方式被称之为程序性坏死。程序性坏死在病毒感染[1]、肝和肾的缺血再灌注损伤[2-3]等疾病中都可发挥重要作用。程序性坏死是一种新的细胞死亡方式，研究程序性坏死能帮助我们更好的理解许多生理病理过程并寻找疾病治疗的新靶点。

1 程序性坏死的发现历程

肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)诱导细胞死亡的研究中，用显微摄影技术观察细胞形态，发现相同的TNF刺激能诱导不同细胞发生不同类型的细胞死亡[4]。TNF诱导F17细胞发生典型的凋亡，却也诱导L-M细胞发生细胞坏死。NF-κB信号通路中的受体相互作用蛋白激酶(receptor interaction protein kinase, RIP)可能是这种新通路中的信号分子。死亡受体FAS也能引起这种坏死，且不依赖caspase活性，却需RIP和FAS蛋白相关死亡区域(Fas-associated protein with death domain, FADD)的参与[5]。小分子抑制剂necrostatin-1，能特异性抑制这种特殊的细胞死亡方式[6]。这种具有可调控的信号通路的细胞死亡过程被命名为程序性坏死(Necroptosis)。Necrostatin-1的分子靶点是受体相互作用蛋白1(RIP1)[7]，necrostatin-1与RIP1的相互结合可使RIP1不激活[8]。此外，受体相互作用蛋白3(RIP3)在程序性坏死通路中的也具有重要作用[9]。混合线性激酶功能域样蛋白(mixed lineage kinase domain-like protein, MLKL)，可能是RIP3下游分子蛋白[10]。此外，Akt[11]和ERK[12]通路也可能参与了程序性坏死。

2 程序性坏死的机制

2.1 程序性坏死的诱导

各种相应配体可以与肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)、CD95(也称FAS)、肿瘤坏死因子受体2(tumor necrosis factor receptor 2, TNFR2)、TNF相关凋亡诱导配体受体1和2(TRAILR1和TRAILR2)结合诱导程序性坏死[4-5]。此外， 谷氨酸盐[12]等也可通过未知分子机制引起程序性坏死。这些因素诱导的程序性坏死中，对TNFR1介导的程序性坏死进行的研究最为系统深入。因此虽然不排除不同受体介导的程序性坏死各自存在特殊的分子机制，下文以TNF诱导的程序性坏死为主，介绍程序性坏死的信号传导通路(图 1)。

图1 程序性坏死分子机制Fig 1 Molecular mechanism ofnecroptosis

2.2 RIP1

RIP1在NF-κB通路中研究较多。已有研究表明，RIP1可以看做该通路中一个处于金字塔顶端的蛋白[5]。当RIP1被泛素化时，则选择NF-κB通路介导细胞生存；当RIP1去泛素化，细胞被迫选择死亡机制时，会出现凋亡或者程序性坏死[5]。因此RIP1泛素化是决定细胞坏死和存活的重要调节步骤。RIP1由3个功能区域组成：氨基末端激酶区域、中间区域和羧基末端死亡区域。程序性坏死过程中，RIP1的丝氨酸14/15，丝氨酸161等位点可发生自身磷酸化，这些位点都位于RIP1的氨基末端激酶区域[7]，提示RIP1氨基末端激酶区域在程序性坏死中起到了重要作用。活化的死亡受体募集RIP1，导致RIP1泛素化。这种泛素化状态由凋亡胞内抑制剂(inhibitor of apoptosis protein, IAP)维持，当IAP的作用去除后，RIP1即可被去泛素化。药物抑制cIAPs或基因敲除cIAPs，可抑制RIP1的泛素化，从而促进程序性坏死[13]。RIP1处于复合体Ⅰ中，复合体Ⅰ由活化的TNFR1聚集 RIP1、凋亡胞内抑制剂1(cIAP1)、cIAP2、TNFR相关因子2(TRAF2)，TRAF5，和TNFR结合死亡区域(TRADD)一起组成[8]。

2.3 RIP3

RIP3与RIP1具有共同的氨基末端激酶区域和羧基末端激酶RIP同型作用功能域(RIP homotypic interaction motif, RHIM)，不同的是RIP3不参与NF-κB通路。去泛素化的RIP1能募集RIP3，与TRADD、FADD和caspase-8一起组成复合体Ⅱ[14]，后者也被称为死亡激发信号复合物(death-inducing signaling complex, DISC)。RIP1的去泛素化状态是复合体Ⅰ转变为复合体Ⅱ的重要因素[14]。去泛素化的RIP1能激活复合体Ⅱ中的caspase-8，后者则黏附并使RIP1和RIP3失活，同时黏附并活化BID和caspase-3，触发caspase依赖的细胞凋亡。然而，当caspase激活被阻断，复合体Ⅱ将启动促坏死信号[5]。

2.4 RIP1-RIP3坏死体

Caspase被抑制后，RIP3通过RIP蛋白家族共同的氨基末端RHIM区域结合成超分子复合体，称为RIP1-RIP3坏死体[15]。RIP1和RIP3相互结合后，去泛素化的RIP1发生自身磷酸化，RIP3又发生直接或者间接的第199位丝氨酸磷酸化[5]，引起程序性坏死[9-14]。Necrostatin-1可破坏RIP1与RIP3的结合，阻断程序性坏死[14]。

MLKL由氨基末端卷曲(Coiled-Coil，CC)区域和羧基末端激酶样区域组成，但缺少与其他蛋白结合的P环和磷酸化活性。MLKL缺失的细胞在程序性坏死过程中停留在坏死体环节，而RIP3可磷酸化MLKL，诱导致程序性坏死。因此，MLKL可能是坏死体的核心组成部分。Necrosulfonamide可以通过抑制MLKL活性阻断程序性坏死[10]。

需指出的是，RIP1或者RIP3可能都不是程序性坏死的必需蛋白，因为敲除RIP1的鼠类胚胎成纤维细胞在TNF诱导下仍可发生程序性坏死[16]。

RIP1-RIP3坏死体下游引起细胞最终坏死的机制比较复杂，如：通过氧化应激途径，增加胞内活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)导致程序性坏死[17]；通过多聚ADP核糖聚合酶1[poly(ADP-ribose) polymerase-1, PARP1][18]和线粒体释放凋亡诱导因子(apoptosis-inducing factor, AIF)途径导致DNA断裂导致程序性坏死等[19]。

3 程序性坏死与缺血再灌注损伤

缺血再灌注损伤过程中细胞具有不同的死亡方式，包括坏死、凋亡和自噬等。程序性坏死的发现为细胞死亡方式添加了新的可能。程序性坏死通路抑制剂Nec-1不仅可以在体外阻止细胞发生程序性坏死，也有结果表明可以增强鼠大脑中动脉栓塞再灌注后的神经恢复。这表明体内缺血再灌注延迟损伤中程序性坏死是细胞死亡的重要方式，这也为研制开发神经保护药物以减少细胞坏死提供了新的靶点[6]。虽然神经细胞缺血再灌注损伤后细胞以发生自噬为主，但这可能因为细胞培养皿中缺乏体内缺血再灌注后出现的其他一些影响因素，如TNF-α、FasL等诱导程序性坏死的配基[20]。

上述实验表明，离体细胞缺血再灌注中细胞死亡的方式主要以自噬为主；而在体环境中细胞因所处环境更复杂，参与细胞死亡的因素更多，可能细胞的坏死以程序性坏死为主。在视网膜缺血模型中，Nec-1预处理组与对照组相比可有效保护视网膜，且在缺血后再给予Nec-1依然有明显保护作用[21]。神经元缺血模型中，发现联合应用Nec-1和凋亡抑制药(HNG，Gly14-humanin)后神经保护效果较好[22]。有关缺血再灌注损伤与程序性坏死的研究仍然较少，且根据不同的器官中细胞发生程序性坏死的组成不同，Nec-1的疗效也各有差异[23]，缺血再灌注损伤与程序性坏死的研究还有待进一步深入。

4 结语和展望

程序性坏死是一种新的细胞死亡方式，已有证据表明它在免疫调节、组织损伤和癌症进展等方面具有重要作用。程序性坏死可被多种刺激诱导，也可被necstatin-1抑制。RIP1和RIP3坏死体是程序性坏死中的重要参与者。目前，程序性坏死的分子机制尚未完全清楚，如FADD在其中的作用并不清晰。程序性坏死的研究必然会为疾病治疗发现更多的治疗靶点。

[1] Hu ZQ, Zhao WH. Type 1 interferon-associated necroptosis: a novel mechanism for Salmonella enterica Typhimurium to induce macrophage death [J]. Cell Mol Immunol, 2013, 10: 10-12.

[2] Shuh M, Bohorquez H, Loss GE,etal. Tumor Necrosis Factor-alpha: Life and Death of Hepatocytes During Liver Ischemia/Reperfusion Injury [J]. Ochsner J, 2013, 13: 119-130.

[3] Linkermann A, Brasen JH, Himmerkus N,etal. Rip1 (receptor-interacting protein kinase 1) mediates necroptosis and contributes to renal ischemia/reperfusion injury [J]. Kidney Int, 2012, 81: 751-761.

[4] Laster SM, Wood JG, Gooding LR. Tumor necrosis factor can induce both apoptic and necrotic forms of cell lysis [J]. J Immunol, 1988, 141: 2629-2634.

[5] Holler N, Zaru R, Micheau O,etal. Fas triggers an alternative, caspase-8-independent cell death pathway using the kinase RIP as effector molecule [J]. Nat Immunol, 2000, 1: 489-495.

[6] Degterev A, Huang Z, Boyce M,etal. Chemical inhibitor of nonapoptotic cell death with therapeutic potential for ischemic brain injury [J]. Nat Chem Biol, 2005, 1:112-119.

[7] Degterev A, Hitomi J, Germscheid M,etal. Identification of RIP1 kinase as a specific cellular target of necrostatins [J]. Nat Chem Biol, 2008, 4: 313-321.

[8] Xie T, Peng W, Liu Y,etal. Structural basis of RIP1 inhibition by necrostatins [J]. Structure, 2013, 21: 493-499.

[9] Zhang DW, Shao J, Lin J,etal. RIP3, an energy metabolism regulator that switches TNF-induced cell death from apoptosis to necrosis [J]. Science, 2009, 325: 332-336.

[10] Sun L, Wang H, Wang Z,etal. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase [J]. Cell, 2012, 148: 213-227.

[11] McNamara CR, Ahuja R, Osafo-Addo AD,etal. Akt Regulates TNFalpha Synthesis Downstream of RIP1 Kinase Activation during Necroptosis [J]. PLoS One, 2013, 8: e56576. doi:10.1371/journal.pone.0056576.

[12] Zhang M, Li J, Geng R,etal. The Inhibition of ERK Activation Mediates the Protection of Necrostatin-1 on Glutamate Toxicity in HT-22 Cells [J]. Neurotox Res, 2013, 24:64-70.

[13] Vanlangenakker N, Vanden Berghe T, Bogaert P,etal. cIAP1 and TAK1 protect cells from TNF-induced necrosis by preventing RIP1/RIP3-dependent reactive oxygen species production [J]. Cell Death Differ, 2011, 18: 656-665.

[14] He S, Wang L, Miao L,etal. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha [J]. Cell, 2009, 137: 1100-1111.

[15] Vandenabeele P, Galluzzi L, Vanden Berghe T,etal. Molecular mechanisms of necroptosis: an ordered cellular explosion [J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2010, 11: 700-714.

[16] Moujalled DM, Cook WD, Okamoto T,etal. TNF can activate RIPK3 and cause programmed necrosis in the absence of RIPK1 [J]. Cell Death Dis, 2013, 4: e465. doi: 10.1038/cddis.2012.201.

[17] Ye YC, Wang HJ, Yu L,etal. RIP1-mediated mitochondrial dysfunction and ROS production contributed to tumor necrosis factor alpha-induced L929 cell necroptosis and autophagy [J]. Int Immunopharmacol, 2012, 14: 674-682.

[18] Wu YT, Tan HL, Huang Q,etal. zVAD-induced necroptosis in L929 cells depends on autocrine production of TNFalpha mediated by the PKC-MAPKs-AP-1 pathway [J]. Cell Death Differ, 2011, 18: 26-37.

[19] Baritaud M, Cabon L, Delavallee L,etal. AIF-mediated caspase-independent necroptosis requires ATM and DNA-PK-induced histone H2AX Ser139 phosphorylation [J]. Cell Death Dis, 2012, 3: e390. doi: 10.1038/cddis.2012.120.

[20] Meloni BP, Meade AJ, Kitikomolsuk D,etal. Characterisation of neuronal cell death in acute and delayedinvitroischemia (oxygen-glucose deprivation) models [J]. J Neurosci Methods, 2011, 195: 67-74.

[21] Rosenbaum DM, Degterev A, David J,etal. Necroptosis, a novel form of caspase-independent cell death, contributes to neuronal damage in a retinal ischemia-reperfusion injury model [J]. J Neurosci Res, 2010, 88: 1569-1576.

[22] Xu X, Chua KW, Chua CC,etal. Synergistic protective effects of humanin and necrostatin-1 on hypoxia and ischemia/reperfusion injury [J]. Brain Res, 2010, 1355: 189-194.

[23] Dong K, Zhu H, Song Z,etal. Necrostatin-1 protects photoreceptors from cell death and improves functional outcome after experimental retinal detachment [J]. Am J Pathol, 2012, 181: 1634-1641.

Molecular mechanism of necroptosis and its effect in IR injury

YE Zhou-heng, LIU Wen-wu, SUN Xue-jun*

(Dept. of Diving Medicine, the Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)

Necroptosis is a special cell necrosis that is capable of being regulated through particular molecular mechanism. Multiple stimuli could induce necroptosis, complex Ⅰ, complex Ⅱ and RIP1-RIP3 necrosome are critical participants in the necroptosis. Also, necrostatin-1 is a special and potent small-molecular inhibitor of necroptosis. Necroptosis could be an important alternative for cell death in ischemia-reperfusion injury.

necroptosis; receptor interaction protein kinase 1; receptor interaction protein kinase 3

2013-06-13

2013-09-24

*通信作者(correspondingauthor)： sunxjk@hotmail.com

1001-6325(2014)03-0414-04

短篇综述

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