党参水提物对D－半乳糖致衰老模型小鼠肝肾SOD活性、MDA含量及超微结构的影响*

耿广琴，杨雅丽，王 晶，黄 勇

(甘肃中医学院基础医学院，甘肃兰州730000)

衰老是一个复杂的多环节生物学过程，是生物界普遍存在的一种自然现象，是一切多细胞生物随着时间的推移而表现出的各个细胞和器官功能的不可逆地、全面地、逐渐地丧失［1］。衰老虽不可逆转，但可以缓解［2］。当今世界人口老龄化问题日趋严重，我国老龄化问题尤为严峻。面对衰老带来的诸多社会、生活问题，开展老年医学及老年生物学方面的研究，探讨延缓衰老的方法，成为当前医学界的研究热点之一。甘肃道地中草药党参具有补中、益气、生津之功效。研究报道显示:注射或服用党参水提物可以增强体质，提高人体免疫力，延缓衰老［3－4］。本实验以D－半乳糖建立致衰老小鼠模型，研究党参水提物对衰老模型小鼠肝肾SOD活性、MDA含量和超微结构的影响，旨在探讨中药党参保肝护肾抗衰老的机制，以使其更好地发挥药用价值，同时为中医药延缓衰老机制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 动 物

PF级昆明种小鼠100只，2月龄，雌雄各半，体质量(18±2)g，购自甘肃中医学院科研实验动物中心，合格证号:SCXK(甘)2011－0001。

1.2 药品、试剂与仪器

党参，采自甘肃岷县，经甘肃中医学院中药学教研室鉴定为白条党参。取党参100 g，分2次煎煮，第1次加10倍量水煎煮1 h，第2次加6倍水煎煮1 h，合并两次提取液，过滤后，浓缩成含生药0.5 g/mL的水煎剂，置4℃冰箱备用，水煎液每5 d制备1次。D－半乳糖，美国Sigma公司产品，临用前用生理盐水配制成12 g/L，备用;考马斯亮蓝测定试剂盒(批号20130819)、丙二醛(MDA)试剂盒(批号20130726)、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(批号20130726)，均购自南京建成生物工程研究所。BS224S型电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司产品;HH－4数显恒温水浴锅，郑州杜甫仪器厂产品;XYJ80－20型离心机，金坛市恒丰仪器厂产品;XW－80A型旋涡混匀器，上海精科实业有限公司产品;VIS－723N型紫外可见分光光度计，北京瑞利分析仪器有限公司产品;JEOL－1230透射电子显微镜，日本电子公司产品。

1.3 动物分组及模型的建立

将100只小鼠，随机分为正常对照组、模型对照组和党参水提物低、中、高剂量组5组，每组20只，雌雄各半。模型对照组、党参水提物各剂量组每日每只小鼠颈背部皮下注射质量分数50 g/L的 D－半乳糖溶液，注射量为0.025 mL/g，正常对照组注射等体积量生理盐水。采用灌胃给药法，党参水提物低、中、高剂量组每日上午按相当于生药量5，10，15 g/kg剂量给药，正常对照组、模型对照组灌服等体积生理盐水，与造模同步，连续42 d。

1.4 检测指标

于末次给药2 h后，称量各组小鼠体质量;断头处死小鼠，迅速剖取胸腺、脾、肝、肾，用预冷的4℃生理盐水洗净表面残血，备用。

1.4.1 胸腺、脾脏指数

将胸腺、脾脏用滤纸吸干，电子天平称量质量，脏器指数=内脏质量(mg)/体质量(g)。

1.4.2 SOD 活性、MDA 含量

分别取大鼠肝、肾组织块约0.3 g，用预冷的生理盐水制备成100 g/L的肝匀浆和肾匀浆，3 000 r/min离心5 min，上清液 －20℃冻存，用于SOD活性、MDA含量测定。SOD活性测定采用黄嘌呤氧化酶法，MDA含量测定采用硫代巴比妥酸法(TBA)法，组织蛋白含量的测定采用考马斯亮兰法。具体操作按照试剂盒说明书进行。

1.4.3 超微结构观察

取大鼠肝及肾皮质组织结构1 mm3，分别固定于1/15 mol/L磷酸缓冲液(PBS)配制的30 g/L戊二醛固定液中2 h;PBS液漂洗3次，每次10 min;10 g/L锇酸固定 1.5 h;PBS液漂洗 3次，每次10 min;500，700，800，900，1000 g/L 乙醇梯度脱水，每次10 min;纯丙酮脱水2次，每次10 min;EPON-812环氧树脂∶纯丙酮(1∶1)浸透2 h;EPON-812环氧树脂包埋;聚合(35℃ 24 h，45℃ 24 h，65℃24 h);半薄切片，甲苯胺蓝染色，光镜下定位;超薄切片，透射电子显微镜观察。

1.5 统计学方法

采用SPSS13.0软件对数据进行统计与分析，数据以平均数±标准误差(mean±SDs)表示，组间比较采用one-way ANOVA分析。以P＜0.05为差别有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠胸腺、脾脏指数对比

与正常对照组对比，模型对照组胸腺指数下降，差别有统计学意义(P＜0.01);与模型对照组对比，党参水提物3个剂量组胸腺指数增高，但差别无统计学意义(P＞0.05)。与正常对照组对比，模型对照组脾脏指数降低，但差别无统计学意义(P＞0.05);与模型对照组对比，党参水提物3个剂量组脾脏指数均升高，但差别均无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

表1 各组小鼠胸腺指数、脾指数对比 mean±SDs

2.2 各组小鼠肝、肾SOD活力及MDA含量对比

正常对照组肝脏中SOD活性显著高于模型对照组(P＜0.01)，党参水提物低、中、高剂量组肝脏中SOD活性均高于模型对照组，其中高剂量组肝脏中SOD活性较之差别有统计学意义(P＜0.05)。正常对照组肾脏中SOD活性显著高于模型对照组(P＜0.01);党参水提物低、中、高剂量组肾脏中SOD活性均高于模型对照组，其中中、高剂量组肾脏中SOD活性较之差别有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。与模型对照组小鼠对比，正常对照组和党参水提物低、中、高剂量组小鼠肝脏组织中MDA含量均降低，其中正常对照组、高剂量组较之差别有统计学意义(P＜0.05)。与模型对照组对比，正常对照组和党参水提物低、中、高剂量组小鼠肾脏组织中MDA含量均降低，其中正常对照组、党参水提物中、高剂量组较之差别有统计学意义(P＜0.05或P ＜0.01)。见表2。

表2 各组小鼠肝、肾中SOD活力、MDA含量对比 mean±SDs

2.3 各组小鼠肝、肾超微结构对比

肝脏超微结构变化见图1。正常对照组肝细胞核呈椭圆形，核膜平整光滑，核周少量异染色质，胞质内细胞器丰富，粗面内质网、线粒体、核糖体等结构正常。模型对照组肝细胞核体积相对于正常略有缩小，核异染色质增多，胞质内局部细胞器线粒体、内质网数量明显减少，残留较多糖原颗粒，及少量脂滴，并可见部分胞质内线粒体肿胀。党参水提物低剂量组肝细胞胞质内部分线粒体肿胀。党参水提物中剂量组肝细胞核形态正常，胞质内线粒体结构正常，内质网轻中度扩张。党参水提物高剂量组肝细胞结构正常。

肾脏超微结构变化见图2。正常对照组肾近曲小管上皮细胞结构、胞质内线粒体正常，游离面致密，微绒毛结构排列整齐。模型对照组肾小管上皮细胞胞质内线粒体肿胀、体积增大，线粒体嵴溶解，减少。党参水提物低剂量组肾小管上皮细胞胞质细胞器肿胀，游离面微绒毛稀疏、脱落或完全消失。党参水提物中剂量组肾小球内部分毛细血管节段系膜细胞、系膜基质轻度增生，但程度明显轻于模型对照组，足细胞足突结构基本正常。党参水提物高剂量组大部分肾小管上皮细胞胞质内细胞器结构正常，仅见少量线粒体肿胀。

图1 各组小鼠肝脏超微结构(×10 000)

图2 各组小鼠肾脏超微结构(×10 000)

3 讨论

中医学认为:衰老是整体性的、退行性的变化过程，而五脏虚损是衰老整体变化中的核心部分。随着年龄增长，机体五脏逐渐虚损，最终五脏皆虚，而尽终其天年。五脏虚损不仅是衰老的特征表现，也是导致衰老的重要原因［5］。五脏之中，肾与衰老的关系最为密切［6］，肝与衰老的关系也非常明朗［7］。“肾元盛则寿延，肾元衰则寿夭”(《医学正传》)，人体衰老与否，以及衰老的速度、衰老的程度、寿命的长短主要取决于肾气的强弱。肝与衰老的关系始载于《灵枢·天年》，曰:“五十岁，肝气始衰，肝叶始薄，胆汁始灭，目始不明……”此明确提出了肝在衰老过程中居于先导地位［8］。本研究结果显示:模型对照组肝、肾中SOD活性明显下降，MDA含量升高，胸腺指数下降，符合衰老的一些病理学特征［9－10］，表明本实验衰老模型的建立是成功的。给予动物模型党参水提物后，可阻止衰老的发展，其中党参水提物高剂量组诸指标基本恢复或接近正常水平，表明:党参可以通过提高肝、肾SOD活性，显著降低体内MDA含量，减轻脂质过氧化对机体造成的损伤，对延缓衰老能起到了积极作用。

电镜观察结果表明:与正常对照组对比，模型对照组肝脏超微结构出现了明显异常改变，主要表现为细胞核体积相对缩小，胞质内线粒体肿胀，线粒体、内质网数量明显减少。给予党参水提物后，中剂量组肝脏超微结构明显改善，高剂量组肝细胞结构恢复正常。与正常对照组对比，模型对照组肾小管上皮细胞胞质内线粒体肿胀，嵴溶解、减少。给予党参水提物后，中、高剂量组肾脏超微结构的异常变化明显缓解。线粒体是细胞内能量合成的主要场所，内质网是蛋白质的合成与加工的部位，细胞作为生物体结构与功能的基本单位，只有保持其完整性，才能正常完成各项生命活动。可见党参可以抑制衰老导致的小鼠肝、肾组织超微结构的异常变化，对维持细胞结构的完整性、维持细胞正常生理功能起到了重要的作用。从衰老致小鼠肝、肾超微结构的变化程度来看，肾脏的损伤程度明显大于肝脏的损伤程度、这与肝、肾中SOD活性、MDA含量的变化一致，这或许是因为，相对于肾脏，肝脏自我修复和代偿能力较强。

综上所述，党参水提物可增强机体的抗氧化能力，减轻脂质过氧化对机体造成的损伤，延缓肝、肾细胞超微结构变化，具有保肝护肾，减慢衰老进程的作用，其中高剂量的效果更为理想。

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