以核酸适体KMF2-1a为基础的乳腺癌细胞靶向化疗药物载体研究

唐鼎

(中山大学工学院 广东广州 510006)

核酸适体是化学抗体的别称,其功能与抗体相似,具有一定的识别功能,属单链短核糖核酸。本研究中通过将乳腺癌细胞MCF1OAT1作为靶向细胞,筛选化学抗体KMF2-1a,后经实验证实该核算具有良好的识别靶细胞能力[1]。本研究以探讨化学抗体KMF2-1a能否被靶细胞特异性内吞为最终目标,分析总结其药物开发潜力。

1 材料及方法

1.1 细胞核系

选取人乳腺癌细胞系MCF-1OAT1和正常上皮细胞MCF1OA1,培养基含有20μg/ml的胰岛素、20ng/ml表皮细胞因子、5%的马血清,癌细胞在37℃下5%的二氧化碳浓度下无菌培养。

1.2 试剂及装置

洗涤缓冲液:用于清洗细胞,以便去除细胞杂质以及荧光基团。其调配方法为:以杜氏磷酸盐缓冲液为基液,在其中加入4.5g/L的葡萄糖以及5mmol/L的氯化镁,摇匀后于4℃无菌保存。

结合缓冲液:用于细胞与核酸适体结合以及荧光基团与核酸适体结合。其调配方法为:以杜氏磷酸盐缓冲液为基液,在其中加入4.5g/L的葡萄糖以及5mmol/L的氯化镁,血清蛋白1mg/ml,摇匀后于4℃无菌保存。

1.3 实验方法

采用DNA合成仪将核酸适体合成,同时采用Biotin进行修饰,同时药物基团不经荧光基团修饰。靶向细胞MCF-1OAT1通过胰蛋白酶进行消化,之后继续培养,其培养密度为培养皿的70%。经过24小时后使用。使用前以洗涤缓冲液冲洗,以去除多余培养基,另加入核酸适体KMF2-1a,在4℃下培养30分钟。以分光光度计检测,将阿霉素溶于杜氏磷酸盐溶液,其阿霉素溶液浓度为2μmol/L,同时加入不同浓度的GC混匀。

2 结果

2.1 特异内吞

在经过胰蛋白酶处理之后,能够去除靶向细胞膜上的相关信号,后经流式细胞仪检测4℃下荧光信号来自细胞内不,证明核酸适体能够被内吞,而对照组并未发现细胞内部存在荧光信号,不能够被内吞。

2.2 药物载体竞争

过量的药物载体在与靶细胞充分培养之后导致信号减弱,故核算适体的结合位减少,能够保证核算适体的识别能力未发生降低。具体数据见表1。

3 讨论

由于核酸适体的理化性质具有极高的优良性,同时其极易被修饰,这就保证了其具有被进一步应用的可能性[2]。虽然大部分核酸适体在不借助外力的情况下并不能同小分子一样被细胞内吞,制约了其适用性,但由于其极高的易修饰性能够使其很容易借助外力的作用,在本研究中,正是通过这样的外力修饰而使得核酸适体更加容易被细胞内吞。在本研究的实验中,细胞处于4℃的环境中会使得细胞及细胞膜的运动处于相对静止状态,此种情况下核酸适体与小分子具有明显的差异,小分子可以自由通过细胞膜而进出细胞,而核酸适体则很难通过细胞膜而进出细胞,此时培养出的核酸适体均处于细胞外部。在培养结束后,以洗涤剂将未发生结合的核酸适体冲洗掉,将细胞放于常规培养环境则会使细胞恢复活性,这种情况下核酸适体被靶细胞内吞。另通过胰蛋白酶将细胞膜消化掉,之后观察到的荧光则发自于细胞内部,此证实核酸适体被细胞正常内吞。

表1 靶细胞内吞核酸适体数据比较

在现阶段的研究中,证实核酸适体能够被前列腺癌细胞内吞,通过后续实验将纳米材料与核酸适体聚合,此证明该纳米材料能够将核酸适体通过特殊途径运送至靶细胞内部。药物载体在本研究中采用KMF2-1a生成,故其能够保证核酸适体的序列并不发生变化,这样能够使其空间形成折叠,在此之后首先测定其是否能够与靶细胞结合,若不能结合则将细胞与药物载体进行共同培养,之后再以定量核算适体进行培养。药物载体在其竞争过程中实现识别靶细胞并结合证明在内吞研究中靶细胞能够携带荧光基团,在试验中通过延长核酸适体的碱基并嵌入阿霉素证明此种情况并不影响靶细胞的内吞。以这些研究为基础,利用抗PSMA核酸适体为载体,将siRNA、毒素、抗肿瘤药物靶向运输到前列腺癌细胞的研究成为该癌症领域研究的热点。

蒽环类药物的激发光谱约为600nm,其中存在2个吸收峰值,当小分子药物与碱基对进行配对时则会导致吸收峰值的消失,在学术界将阿霉素荧光信号消失的现象称之为淬灭,通过该淬灭现象能够检测到阿霉素是否能够成功进入药物载体,另外随着药物载体浓度的增加会导致阿霉素信号的峰值有节奏的消失,这就证明阿霉素与碱基配对成功。

综上所述,本研究中采用流式细胞仪进行检测能够证实靶细胞MCF-1OAT1具有特异内吞核酸适体KMF2-1a,在随后的核酸适体加入碱基作为药物载体的实验中证实采用阿霉素能够嵌入碱基,并对互补空间结构产生一定的影响,在此基础之上成功制成的药物载体与阿霉素能够形成物理共聚,这就能够为其进一步研究打下坚实的基础。

[1]牛瑞芳.肿瘤特异性标志及生物靶向纳米制剂的研究[D].天津:天津大学,2012.

[2]陈帅君.叶酸受体介导的载顺铂磁性纳米pH敏感靶向给药系统研究[D].广州:南方医科大学,2013.

[3]杨传旭,葛志强.以适体作为药物“靶向载体”的研究进展[J].中国医药生物技术,2010,04(05):1297-1299.