猪肝中克伦特罗的测定─反相高效液相色谱法

陈肇臻，刘小刚

（龙岩市产品质量检验所，福建 龙岩 364000）

1 引言

盐酸克伦特罗（Clenbuterol）俗称“瘦肉精”,为人工合成的肾上腺素β-受体激动剂,是一种同化激素。它的化学性质稳定，能促进体内脂肪分解代谢、增加蛋白质合成，促进动物生长并显著提高家畜瘦肉率，在动物的肝、肾、肺组织中显著蓄积。20世纪90年代它曾作为科研成果以饲料添加剂引入市场并加以推广，但其强而持久的松弛支气管平滑肌及对心脏有兴奋的作用，能引起心率过速失常，骨骼肌肉震颤，代谢紊乱。人食用了饲喂克伦特罗作为添加剂的动物所产生的畜产品后，残留的克伦特罗可导致人体肌肉震颤、心悸、神经过敏、头痛、目眩、恶心、呕吐、发烧、战栗等症状，对心脏病、高血压、甲亢、前列腺肥大、青光眼等患者危害更大，食用高残留（大于0.1mg·kg-1）的内脏组织或累计摄入量超过一定值（体重60kg，最大可摄入0.24μg）即可引发食物中毒。1997年我国明令禁止在畜牧行业生产、销售和使用盐酸克伦特罗，但国内仍有一些畜牧养殖企业暗中地在非法使用克伦特罗来增加动物的瘦肉率从而引发一连串的食物中毒事件。目前，盐酸克伦特罗的检测方法[1]有很多种,常用的有HPLC法[2-7]、GCMS法[8]、LC-MS法[9]及酶联免疫法[10]，文中是在GB/T5009.192-2003[11]基础上改进色谱分离体系，实现高选择性、无干扰、定性定量检测盐酸克伦特罗。

2 材料与方法

2.1 试剂

盐酸克伦特罗标准物质（Dr.Ehrenstorfer GmbH，纯度98.5%）；甲醇；乙腈：色谱级；乙酸乙酯：AR；氨化甲醇：5%；碳酸钠溶液：10%；盐酸溶液：磷酸二氢钾：GR；

2.2 主要仪器

Waters e2695高效液相色谱仪（2998二极管阵列检测器）；Shisedo SCX分析柱；梅特勒-托利多XS205分析天平、莱驰GM200捣磨机；Beforce BF25匀浆机；VORTEX-5旋涡混合器；湘仪TGL-20M高速冷冻离心机；HH6水浴锅、Organomation氮吹浓缩仪；Supelco 固相萃取装置（CNWBOND SCX 苯磺酸SPE柱，500mg/6ml）；SK5200H超声波清器。

2.3 色谱条件

检测器：二极管阵列检测器，波长210nm； 色 谱 柱：Shisedo Capcell PAK SCX UG80 150mm×4.6mm，柱温35℃；流动相：乙腈：磷酸二氢钾（0.05mol·L-1，磷酸调pH=3.0）=30:70；流速：1.0ml/min；进样量：10μl。

2.4 标准溶液的配制

盐酸克伦特罗标准储备溶液：精确称取一定质量的盐酸克伦特罗于容量瓶中，甲醇定容。封口膜-18℃保存。

克伦特罗工作标准使用液系列：盐酸克伦特罗标准储备溶液逐级用甲醇稀释成含185.6ng·ml-1、464.0ng·ml-1、928.0ng·ml-1、1392ng·ml-1、1856ng·ml-1、2320ng·ml-1、4640ng·ml-1、9280ng·ml-1、23.2μg·ml-1和46.4μg·ml-1克伦特罗于容量瓶备用。

2.5 样品的前处理方法

鲜猪肝剔除筋膜，捣磨机搅成糜状样品密封备用。称取5g样品于50ml离心管中，10ml10%碳酸钠溶液，漩涡混合2min，80℃水浴60min，冷却后加15ml乙酸乙酯，匀浆2min，8000rpm冷冻离心5min，上清液移至另一离心管中，用15ml乙酸乙酯重复提取残渣一次，合并提取液。向乙酸乙酯提取液加入5ml0.1mol·L-1盐酸溶液漩涡混合2min，8000rpm冷冻离心3min，移取下层水相，用5ml0.1mol·L-1盐酸溶液重复提取一次，合并水相混匀后pH调至5.0待净化。

试样加标提取：称取5g样品于50ml离心管中，10ml10%碳酸钠溶液，加克伦特罗标准使用液，后同上处理；

活化：依次向强阳离子SPE柱（500mg/6ml）加入5ml甲醇，5ml水，5ml30mmol·L-1盐酸溶液，每步骤见流出液关闭SPE活塞10min活化平衡SPE柱，SPE柱下筛板至SPE柱活塞间不得存在气泡，弃去流出液。

上样：SPE上筛板剩少许30mmol·L-1盐酸溶液时将上述水相反萃取液上柱，流速控制在每4秒1滴，弃去流出液。

淋洗：依次用5ml水，5ml甲醇淋洗，弃去流出液并抽干SPE柱。

洗脱：用6ml氨化甲醇洗脱，流速控制在每4秒1滴并抽干SPE柱，收集洗脱液于2ml定量浓缩管中，45℃氮吹近干，自然挥干。

测试液：甲醇定容2ml，漩涡混合1min，超声1min，过0.45μm尼龙针式滤器备用。

3 结果与讨论

3.1 色谱条件的选择

3.1.1 溶剂

盐酸克伦特罗为碱性药物（pKa≈9.6），在碱性条件下以分子形式存在，易溶于乙酸乙酯。该方法中用10ml10%碳酸钠溶液碱化基质，80℃水浴沉淀蛋白，再用乙酸乙酯将盐酸克伦特罗萃取出来，用5ml0.1mol·L-1盐酸溶液酸化乙酸乙酯提取液，盐酸克伦特罗转化为离子态，更易被反萃取至水相溶液中,水相pH值调至5.0。

3.1.2 SPE柱保留及洗脱速度

SPE柱上样时：试样中分子态克伦特罗结构式中的NH经盐酸酸化键合成NH2呈带正电荷的离子态与SCX苯磺酸吸附剂带负电荷SO3之间是通过离子作用力在弱酸性、不存在高选择性的反离子及低离子强度的溶剂体系中相互吸引实现保留，流速太快导致保留不住，流速控制在每4秒一滴。同样，洗脱时流速太快将导致解析不完全，流速也控制在每4秒一滴。

3.1.3 缓冲液

理想的缓冲液的pH值和离子强度应使克伦特罗与SCX阳离子分析柱快速结合，而杂质不与交换柱结合，连续不断的弱酸性阴离子洗脱液使克伦特罗从SCX分析柱上快速解离，该文选用磷酸二氢钾作为阴离子缓冲液。

3.1.4 流动相

乙腈-磷酸二氢钾流动相体系中，乙腈比率从30%提高到40%时，保留时间从24.03min缩短至15.10min（见图4），峰高及半峰宽均好于后者，但峰面积响应不变；缓冲盐比率提高到80%时半峰宽、出峰时间明显展宽、延后。缓冲盐pH值为5时克伦特罗离子化正电荷速度较pH3.0时慢，与SCX苯磺酸吸附剂带负电荷SO3相互吸引实现保留变慢，进而阴离子缓冲盐洗脱速度变慢，出峰延后，基线波动大；缓冲盐pH为3.0时可降低克伦特罗与阳离子交换树脂的静电引力，出峰较pH5.0时缩短约2min且基线波动小，峰高及半峰宽均好于后者但两者峰面积响应不变。甲醇-磷酸二氢钾流动相体系，同等色谱条件下出峰延后25min，响应降低，峰明显展宽，失去定性定量作用。

3.1.5 色谱分离系统

按2.5提取的加标试样提取液SCX阳离子分离 体 系 较 GB/T5009.192的 4.6mm×250mm 5μm C18分离体系（流动相：甲醇+水，流速1.0ml/min，柱温35℃）保留时间长，无溶剂峰及其他杂峰干扰，定性定量具有非常明显优势，检出限及定量限均优于GB/T5009.192的C18分离体系。克伦特罗极性较弱，极易被洗脱，保留时间短，GB/T5009.192的C18分离体系无论如何优化色谱条件，溶剂峰及其他杂峰干扰严重，基本失去定性定量意义。

3.1.6 检测波长

克伦特罗在210nm、244nm及298nm处有三个特征吸收峰（见图5、图6），210nm处峰高响应为244nm的4倍，噪声未见同步放大，该方法采用阳离子交换，干扰明显低于C18分离系统，故采用210nm检测波长定量予获得较高的响应。

3.2 标准曲线

图1 克伦特罗标准溶液的工作曲线图

从图2中可以看出，克伦特罗保留时间23.7min左右，基线得到很好的分离。图1以浓度为Y轴，峰面积为X轴建立标准曲线，标准曲线 回 归 方 程 ρ(μg·ml-1)=-0.02450+2.0046×10-6S,相关系数r=0.99995, 线性范围185.6ng·ml-1 ～ 46.4μg·ml-1，仪器实际检出限 0.15μg·ml-1，定量限2.0μg·kg-1（10倍噪声计）。

图2 克伦特罗标样重叠色谱图

3.3 实际样品测定及加标回收率、重复性

在样品中加入浓度为2320ng·ml-1标准溶液1.0ml、2.0ml、5.0ml按2.5提取的加标试样提取液，样品加标回收率92.4～95.2%。

图3 鲜猪肝加标色谱图

图4 克伦特罗标准溶液色谱图（乙腈:磷酸二氢钾=40:60）

图5 鲜猪肝加标吸收光谱图

图6 克伦特罗标样吸收光谱图

表1 回收试验

标品按2.3色谱条件连续6次进样，保留时间RSD6为0.06%，峰面积RSD6为0.76%。

称取样品6个加标按2.5提取，2.3色谱条件依次进样，保留时间RSD6为0.18%，加标样品中克伦特罗含量RSD6为0.22%，回收率可稳定在92.4～ 95.2%。

4 结论

该方法的灵敏度、准确性、精密度、重复性完全可满足检测要求且简便快速，避免了GCMS法衍生苛刻条件且衍生产物室温下不稳定，检验成本低于GCMS、LCMSMS法。

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